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丝素蛋白纳米纤维直径对嗅鞘细胞生长和迁移影响的研究

作　者: 吴鹏
导　师: 沈忆新
学　校: 苏州大学
专　业: 骨外科学
关键词: 嗅鞘细胞 丝素蛋白 纳米纤维 细胞生长 细胞迁移 组织工程
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的探讨不同直径丝素蛋白纳米纤维(silk fibroin nanofibers,SFS)对嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)生长及迁移的影响,为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)修复材料的选择提供实验基础和理论依据。方法(1)SFS的制备:运用静电纺丝技术制备SFS,并通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察。(2)OECs的纯化培养:取SD大鼠嗅球新鲜分离的OECs,采用改良差速贴壁法纯化培养。(3) OECs与SFS的复合培养:将纯化后的OECs分别接种至以左旋多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)(对照组)和SFS(400nm,1200nm)(实验组)包被盖玻片的培养皿中进行复合培养。(4)检测指标:复合培养不同时间点行倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞形态、生长、分布及与材料黏附情况。神经生长因子受体p75(nerve growth factor receptor p75,NGFR p75)及胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色测定细胞表现型,噻唑兰(Thiazoyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)法测定支架材料上OECs的增殖情况,死活细胞染色试剂及流式细胞术检测细胞生存率,细胞的迁移通过Leica AF6000活细胞工作站拍摄得到图像,活细胞工作站动态跟踪观察OECs生长迁移并计算细胞迁移轨迹、迁移行为、迁移效率、迁移速率。结果(1)倒置相差显微镜示SFS上培养的OECs与对照组相比,细胞沿丝素纤维迁移,细胞突起方向走向较一致,形态特征无显著差异。(2)扫描电镜观察显示SFS平均直径约为(395±3)nm、(1210±7)nm,纤维呈三维立体网状结构,分布均匀,OECs与材料结合紧密,且细胞突起方向与纤维走向较一致,形态与对照组无显著性差异。(2)免疫荧光染色:培养4d时,免疫荧光染色显示实验组NGFRp75/GFAP阳性,OECs在SFS材料上仍保留其特有的表现型。(3)MTT检测显示:培养第4d时,对照组OECs的吸光度值较1200nm直径的材料OECs的吸光度值有显著差异(p<0.05),培养第7d时,对照组OECs的吸光度值较实验组吸光度值有显著差异(p<0.05),而且OECs在400nmSFS材料上的吸光度值比在1200nmSFS材料上的吸光度值高,有统计学意义(p<0.05)。400nmSFS相比1200nmSFS更能促进OECs的增殖。(4)死活细胞染色试剂检测显示:在培养第4、7天时,实验组细胞形态较对照组正常,成活率较高,两组死亡细胞数比较无显著性差异。(5)流式细胞术检测结果显示:在培养第4天时,实验组OECs较对照组OECs的凋亡率无显著差异(p>0.05)。(6)活细胞工作站观察显示:细胞的迁移速率,迁移效率和对照组相比均无显著地统计学差异(p>0.05),两种直径的SFS对OECs在纤维上的迁移速率、迁移效率没有显著影响。结论不同直径丝素蛋白纳米纤维对嗅鞘细胞的生长与迁移均具有支持和引导作用,SFS有望成为一种新型的组织工程支架材料结合OECs移植修复脊髓损伤。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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