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微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及cDNA文库的构建

作　者: 李文卉
导　师: 罗建勋；刘磊；殷宏
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 微小牛蜱 Bm86基因 表达 毕赤酵母 cDNA表达文库 构建
分类号: S852.746
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


以微小牛蜱饥饿幼蜱为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增了微小牛蜱Bm86基因,并将其与真核表达载体pPIC9K进行重组;电转化毕赤酵母后,用0.5%甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot方法对培养上清中的表达产物进行分析。结果表明:本试验自从微小牛蜱中成功克隆了Bm86基因,它与自GenBank上下载的国外发表的Bm86基因的同源性达97.4%,并构建了真核表达载体pPIC9K-Bm86,转化后经PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。通过甲醇诱导,重组菌株高效地分泌表达了Bm86蛋白,表达浓度为0.36mg/mL,占分泌总蛋白质的32%。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约为68KD,具有免疫活性。该研究为大量获得重组Bm86蛋白,研制微小牛蜱分子疫苗奠定基础。　为了自微小牛蜱获得新的免疫相关基因,构建了微小牛蜱cDNA文库。从微小牛蜱幼蜱研磨物中提取总RNA,并分离纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,接着在其两端加EcoRⅠ/Hind　Ⅲ定向接头;然后将所产生的cDNA分子用Mini Column Fractionation　凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体的EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切位点之间,体外包装后得到我国微小牛蜱幼虫cDNA文库。经测定,所构建的表达文库的容量为4.5×105pfu/ml,扩增后的文库库容量为7.2×1010pfu/ml,重组率为97%,这说明所构建微小牛蜱幼虫cDNA表达文库库容量大、重组率高,为进一步分离其功能性抗原基因奠定基础。

全文目录


文献综述  5-14
前言  14-16
第一章 微小牛蜱Bm86基因的克隆及在毕赤酵母中的真核表达  16-40
  摘要  16-17
  Abstract  17-18
  材料和方法  18-40
    1.实验材料  18-19
      1.1 蜱种、菌种和载体  18
      1.2 酶和试剂  18
      1.3 微小牛蜱 Bm86 基因的引物设计  18
      1.4 培养基  18-19
      1.5 溶液  19
      1.6 仪器与设备  19
    2.实验方法  19-29
      2.1 微小牛蜱总 RNA 的提取  19-21
      2.2 目的基因 Bm86 的扩增  21
      2.3　PCR 产物的回收  21-22
      2.4 目的基因的克隆  22-23
      2.5 重组克隆质粒的提取与鉴定  23-24
      2.6 毕赤酵母重组表达载体的构建  24
      2.7 重组载体 pPIC9K-P2 电转化毕赤酵母 GS115  24-25
      2.8 重组酵母菌株的筛选  25-26
      2.9 重组酵母菌株的诱导表达  26
      2.10 表达产物的初步纯化、检测和鉴定  26-29
    3.实验结果  29-35
      3.1 目的基因 Bm86 的获得  29-32
      3.2 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9K-Bm86 的构建及鉴定  32-33
      3.3　重组表达载体 pPIC9K-Bm86 电转化毕赤酵母宿主菌  33
      3.4 重组毕赤酵母菌株的筛选  33-34
      3.5 表达产物的检测及鉴定结果  34-35
    4.讨论  35-40
      4.1 目的基因 Bm86 的克隆  35
      4.2 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9K-Bm86 的构建  35
      4.3 毕赤巴斯德酵母在外源蛋白生产中的优势  35-37
      4.4 表达载体与宿主染色体的整合  37
      4.5 问题与展望  37-40
第二章 微小牛蜱cDNA表达文库的构建  40-51
  摘要  40
  1　材料与方法  40-48
    1.1试验材料  40-41
    1.2 实验方法  41-48
  2　结果  48-50
    2.1　总 RNA 的检测  48-49
    2.2　mRNA的检测  49
    2.2 双链 cDNA 的检测  49
    2.4　cDNA 文库库容量  49-50
  3.讨论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-59
个人简介  59-60
导师简介  60-61
独创性声明  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学 > 兽医昆虫学 > 蜱、螨类
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