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RAD51C基因与Eμ-Myc p19Arf-/-细胞药物敏感性及其表达在乳腺癌中的临床意义

作　者: 廖绍光
导　师: 王雅杰
学　校: 第二军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: RAD51C 基因敲减 奥拉帕尼 细胞周期 凋亡 乳腺癌
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景同源重组（homologous recombination，HR）是细胞中的一项基础生命活动，在维持细胞基因组完整性，修复内源或外源性原因造成的DNA双链损伤（double-strandbreak，DSB）中起重要作用。细胞在发生DSB时，主要依靠两种方式进行修复，一种是同源重组修复（homologous recombination repair, HRR），另一种是非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）。HR作为一种无差错的修复方式，是绝大多数细胞生命活动所必须的。RAD51C是DNA损伤修复（DNA damage response，DDR）过程中的一个重要角色，将DNA损伤信号传递到下游并保证了HR参与损伤的修复。在DNA损伤发生后数分钟内，RAD51C在RAD51聚集之前即定位到损伤处，提示RAD51C在参与了HR早期的反应。同时，DNA损伤时ATM磷酸化激活下游CHK2蛋白的过程，需要RAD51C的参与，从而阻滞细胞周期，引起DNA修复或凋亡等反应。该研究还发现，DNA损伤后，RAD51C聚集形成的焦点到RAD51焦点消失后仍然持续存在，提示RAD51C可能在HR的后期也发挥作用。另外许多研究也证实了RAD51C在HR后期中的重要作用。比如RAD51C参与了HR中Holliday交叉（Holliday Junction，HJ）的分支迁移和拆分。研究也发现，在鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）中敲除RAD51C基因后HJ拆分活动显著减少。由于HR通路在DNA损伤修复中起到关键性作用，可以预见，HR相关基因的突变将会导致无法修复的DNA损伤的积累，并因此引起细胞癌变，最终导致肿瘤发生。研究发现，RAD51C基因突变增加了乳腺癌和卵巢癌的发病风险。此外，RAD51C基因突变还与范科尼贫血（Fanconi anemia, FA）样疾病的发病相关。鉴于RAD51C基因在DNA损伤修复中的重要作用，本课题研究了RAD51C基因表达状态对肿瘤细胞及乳腺癌患者的影响。实验共分为三个部分：第一部分，利用RAD51C基因敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤细胞，用三十余种常用抗肿瘤药物作用于该细胞，筛选出RAD51C基因敲减后对其药物敏感性影响较大的药物；第二部分，利用PARP-1抑制剂奥拉帕尼作用于RAD51C基因敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤细胞，观察奥拉帕尼对该细胞周期及凋亡的影响；第三部分，利用我科前期建立的组织芯片库，通过免疫组化的方法研究人乳腺癌和癌旁组织中RAD51C蛋白表达情况，并对其表达与乳腺癌临床病理学特征的相关性进行了探讨。第一部分RAD51C基因表达抑制对抗肿瘤药物在鼠Eμ-Mycp19Arf-/-细胞中作用的影响目的：通过逆转录病毒载体靶向抑制Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤细胞中RAD51C基因的表达，在30余种药物中筛选出RAD51C基因敲减后对其药物敏感性影响较大的药物。方法：利用RAD51C-shRNA逆转录病毒载体感染Eμ-Myc p19Arf-/-细胞株，构建RAD51C基因稳定敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞系。用30余种药物作用于该细胞系，采用以流式细胞仪为基础的GFP竞争测定方法在Eμ-Myc p19Arf-/-细胞系中对RAD51C基因敲减前后30余种药物的作用进行比较。结果：用RAD51C-shRNA逆转录病毒载体感染Eμ-Myc p19Arf-/-细胞可以有效降低该细胞内RAD51C基因的表达。RAD51C基因沉默的细胞在CPT, DDP,17-AAG和olaparib等药物作用后死亡率高于RAD51C正常表达的细胞。结论：RAD51C基因敲减后，会增加Eμ-Myc p19Arf-/-细胞对CPT, DDP,17-AAG和olaparib等药物的敏感性。第二部分奥拉帕尼对RAD51C基因敲减的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-细胞DNA损伤及周期、凋亡的影响目的：通过western blot检测奥拉帕尼作用后细胞内γ-H2AX表达水平变化，流式细胞仪检测奥拉帕尼对RAD51C基因敲减的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-细胞周期及凋亡的影响。方法：利用RAD51C-shRNA逆转录病毒载体感染Eμ-Myc p19Arf-/-细胞株，构建RAD51C基因稳定敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞系。用一定浓度的奥拉帕尼作用于该细胞，一定时间后利用western blot检测奥拉帕尼作用后细胞内γ-H2AX表达水平变化，并用流式细胞仪检测该细胞周期分布及凋亡的变化。结果：奥拉帕尼作用后，细胞内γ-H2AX表达明显增高，并且RAD51C基因敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞中γ-H2AX增高较RAD51C正常表达的细胞明显；RAD51C正常表达及基因敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞处于早期S期的比例增多，提示细胞被阻滞在S期；并且两种细胞在奥拉帕尼作用后早期和晚期凋亡率均明显增加，RAD51C敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均高于RAD51C正常表达的细胞。结论：奥拉帕尼作用后会使Eμ-Myc p19Arf-/-细胞内累积DSB，并使RAD51C敲减的Eμ-Myc p19Arf-/-细胞周期阻滞在S期，继而引起细胞凋亡。第三部分乳腺癌组织中RAD51C蛋白的表达及其临床意义目的：通过免疫组化的方法研究人乳腺癌和癌旁组织中RAD51C蛋白表达情况，并对其表达与乳腺癌临床病理学特征的相关性进行探讨。方法：收集213例乳腺癌和99例癌旁组织的手术标本，制作乳腺癌组织芯片，利用免疫组化技术研究RAD51C在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况及其临床意义。结果：乳腺癌及癌旁组织中RAD51C表达无显著差异。RAD51C蛋白阳性表达率在HER2表达阳性的患者中明显高于HER-2表达阴性患者，其差异具有统计学意义。RAD51C阴性表达患者的总生存期明显长于RAD51C阳性表达的患者，其差异具有统计学意义。COX比例风险回归模型进行预后独立因素提示RAD51C表达状态是乳腺癌患者的独立预后因素。结论：RAD51C蛋白表达在不同HER-2表达患者中有差异，RAD51C阴性表达患者总生存期长，并且RAD51C表达状态是乳腺癌患者的独立预后因素。因此，RAD51C表达检测对乳腺癌患者的预后判断有一定指导意义。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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