学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

miR-106a和miR-17-5p在反式二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变中的作用

作　者: 吴延
导　师: 蒋义国
学　校: 广州医学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: 反式二羟环氧苯并芘恶性转化 microRNA miR-106a miR-17-5p 人支气管上皮细胞模拟物抑制剂
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 63次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

背景与目的苯并[a]芘(B[a]P)是第一个被发现的广泛分布于环境中的环境化学致癌物,其经代谢激活产生最终致癌物anti-BPDE后才具有致癌性。MiRNA是一类数量众多的非编码小RNA分子,能够通过与靶基因的3’端非翻译区配对结合引起翻译抑制或mRNA的降解而起到癌基因或抑癌基因的作用。本研究中,利用anti-BPDE诱导的恶性转化人类支气管上皮细胞(16HBE-T)探讨miRNA在化学致癌中的可能机制。使用qRT-PCR法测量miR-106a成熟体和miR-17-5p成熟体的表达水平,并进一步使用了特异的miRNA抑制剂和模拟物下调或上调恶性转化细胞里的miR-106a或miR-17-5p活性,以此来确定其表达高低对恶性转化细胞生物学特性的影响。结果显示,与对照细胞相比(16HBE-N),miR-106a和miR-17-5p在恶性转化细胞中存在过度表达。转染抑制剂沉默16HBE-T细胞的miR-106a或miR-17-5p后会抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡、抑制非依赖性生长。相反,转染模拟物上调16HBE-T细胞中的miR-106a或miR-17-5p水平后细胞表现出完全相反的特性。此外,对miR-106a还进行了裸鼠实验,结果发现,注射了转染miR-106a抑制剂的细胞的肿瘤组生长速度明显减缓,而注射了转染miR-106a模拟物的细胞的肿瘤组生长速度显著增快。这些结果表明miR-106a和miR-17-5p在化学致癌剂诱导的转化中可能起到癌基因的作用。因此,敲除恶变细胞中的miR-106a和miR-17-5p可能是一种潜在的治疗方法。方法1.检测miRNA的表达使用TaqMan MicroRNA assays试剂盒鉴定16HBE-N和16HBE-T细胞中miRNA的表达水平。2.瞬时转染miRNA模拟物和抑制剂按照Lipofectamine 2000说明书进行瞬时转染。模拟物转染组设试验组(miR-106a mimic和miR-17-5p mimic)和阴性对照组(mimic NC),抑制剂转染组设试验组(anti-miR-106a和anti-miR-17-5p)和阴性对照组(inhibitor NC),此外,还设置了转染试剂Lipofectamine 2000阴性对照组(Lipo-2000 NC)。转染5小时后评价转染效率,72小时后检测miRNA表达水平改变情况。3.细胞周期实验转染72小时后,用PI和RNase A着色,以流式细胞仪分析细胞周期。4.细胞增殖实验在96孔板里接种相同数量的16HBE-T细胞后,培养24小时,再分组进行转染。在转染后第五天用CCK-8试剂和酶标仪检测细胞的增殖能力。5.凋亡实验转染72小时后,使用Annexin V/PI试剂盒和流式细胞仪检测转染和非转染细胞的凋亡率。6.软琼脂实验将500个细胞重悬于1ml 0.3%低熔点琼脂糖,然后铺到已含1ml 0.6%半固体低熔点琼脂糖的12孔板里。低熔点琼脂糖用含10%血清的培养基配置。放置培养箱中培养3周后,计算克隆数。7.裸鼠试验转染24小时后,收集转染或未转染组细胞,用PBS重悬细胞使细胞密度为1×107个/ml,取0.2 ml皮下注射入5周龄的BALB/c裸鼠后腿内侧。成瘤后每五天测量肿瘤体积绘制生长曲线,饲养42天后,处死裸鼠,取出肿瘤称重、4%甲醛固定后进行病理鉴定。8.统计分析各实验组数据均以均数±标准差表示,采用SPSS17.0统计软件分析。满足正态分布且方差齐同的两组间miRNA表达差异的比较,采用两组独立样本的t检验;三组以上的比较采用方差分析,组间两两比较方差齐同时采用LSD-t检验。不满足正态分布时采用非参数检验。显著性水平a=0.05。结果1. 16HBE-T细胞中miR-106a和miR-17-5p过表达16HBE-T细胞中的miR-106a成熟体和miR-17-5p成熟体表达水平分别是16HBE-N的2.9±0.2倍和2.3±0.1倍(P<0.05)。2. 16HBE-T细胞转染后miRNA表达改变与16HBE-T相比,转染miR-106a抑制剂或模拟物后miR-106a表达水平分别为0.3±0.1和1.9±0.3倍(P<0.05),转染miR-17-5p抑制剂或模拟物后miR-17-5p表达水平分别为0.4±0.1和1.7±0.2倍(P<0.05)。3.转染后细胞周期分布改变与inhibitor NC组比较,anti-miR-106a组和anti-miR-17-5p组均出现G0/G1期细胞比例增多、S期细胞比例减少(P<0.05)。与mimic NC组比较,转染miR-106a mimic后G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多(P<0.05)。4.转染后细胞增殖能力改变与对照组相比,转染miR-106a抑制剂或模拟物后细胞的增殖能力分别降低了0.37±0.01和升高了0.45±0.07倍(P<0.05),转染miR-17-5p抑制剂或模拟物后细胞增殖能力分别降低了0.29±0.03倍和升高了0.34±0.02倍(P<0.05)。5.转染后细胞凋亡率改变抑制剂试验组比抑制剂对照组出现更高的凋亡率(P<0.05),而各阴性对照组与未转染组相比,凋亡率差别。同时,模拟物试验组与模拟物对照组相比凋亡率大幅下降(P<0.05)。6.转染后细胞集落形成率改变抑制剂试验组比抑制剂对照组和未处理组细胞出现更少的克隆数(P<0.05)。而模拟物试验组与模拟物对照组相比克隆数增多(P<0.05)。7.裸鼠实验在6种处理组中,anti-miR-106a组的肿瘤生长速度最慢(P<0.05),miR-106a mimic组的肿瘤生长速度最快(P<0.05),而16HBE-T组、Lipo-2000 NC组、inhibitor NC组、mimic NC组的肿瘤生长速度无明显差别。接种42天后收获肿瘤,结果发现,anti-miR-106a组的肿瘤平均重量(35.7±9.6 mg)明显低于inhibitor NC组的肿瘤平均重量(110.8±15.3 mg) (P <0.05)。miR-106a mimic组的肿瘤平均重量(340.4±23.1 mg)明显高于mimic NC组的肿瘤平均重量(127.6±21.9 mg) (P <0.05)。经病理学鉴定发现,注射此6种细胞的小鼠均生长出鳞状细胞癌。结论1.anti-BPDE诱导恶性转化的人支气管上皮细胞16HBE-T存在miR-106a和miR-17-5p成熟体表达上调。2.miR-106a和miR-17-5p成熟体表达水平改变能够影响16HBE-T细胞生物学特性。3.miR-106a和miR-17-5p在环境化学致癌剂诱导的细胞恶变中具有重要作用,是两个小分子癌基因,能抑制细胞凋亡,增加细胞恶性程度。本项目创新性:首次探讨了miR-106a和miR-17-5p在毒理学尤其是化学致癌领域中的功能,为癌症的机制研究提供了新依据。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
材料与方法  15-25
结果  25-38
讨论  38-41
结论  41-42
参考文献  42-46
综述  46-56
  参考文献  51-56
在校期间完成与发表的论文  56-57
致谢  57-58

miR-106a和miR-17-5p在反式二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变中的作用

内容摘要

全文目录

相似论文