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金雀异黄素对系膜细胞表型转换和细胞外基质作用的实验研究

作　者: 刘楠梅
导　师: 袁伟杰
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 金雀异黄素非肌肉型肌球蛋白重链细胞外基质纤连蛋白基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶抑制剂-1 蛋白酪氨酸激酶
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

背景：系膜细胞(MC)的肥大表型转换、细胞外基质(ECM)分泌增加、降解减少是糖尿病肾病(DN)发生发展的重要环节。糖尿病(DM)的饮食治疗一直广为重视，多年来人们也一直进行着关于DN最佳饮食治疗方案的探索。近年在DN大鼠模型的研究中发现：大豆蛋白替代动物蛋白可减轻DN动物肾脏高滤过和蛋白尿的程度。进一步研究发现大豆蛋白的这一有益作用与其中所含的多酚类混合物(大豆异黄酮)有关。金雀异黄素(genistein)是大豆异黄酮的主要生理活性成分，它可通过抑制酪氨酸蛋白激酶(PTK)、核糖体S6激酶等多种酶的活性发挥生理作用，它还可通过作用于雌激素受体发挥雌激素样作用和拮抗雌激素作用，此外尚具有抗氧化作用。有文献报道DN的MC表型转换标志物非肌肉型肌球蛋白重链(SMemb)的表达与PTK活性密切相关。又有文献报道金雀异黄素可以抑制肾小球MC纤连蛋白(Fn)的合成，减少ECM的积聚。非肾研究显示金雀异黄素可以调节基质金属蛋白酶降解系统的平衡，有助于ECM的降解。目前关于金雀异黄素对DN影响的研究鲜有报道，但许多间接证据提示它对DN可能具有良好的治疗作用。目的：为了研究金雀异黄素对DN环境下大鼠MC肥大表型转换标志物SMemb和ECM分泌及降解的影响，我们拟在细胞水平以不同浓度的金雀异黄素作用于高糖培养下大鼠MC，在动物水平以同一浓度的金雀异黄素作用于DM大鼠不同时间，观察细胞表型转换标志物SMemb、ECM主要成分Fn、ECM降解酶系统基质金属蛋白酶—2(MMP-2)／基质金属蛋白酶抑制剂—1(TIMP-1)表达的变化，同时观察金雀异黄素对DM大鼠肾脏病理及影响肾脏病进展的糖脂代谢紊乱的影响，并进一步探讨金雀异黄素发挥作用的可能机制；为明确金雀异黄素在DN治疗中的地位及意义提供实验依据。方法：本课题分为体外实验和体内实验。体外实验设立低糖对照组(6％小牛血清的低糖DMEM，不加金雀异黄素)、高糖组(6％小牛血清的高糖DMEM，不加第_军医人学2001级硕卜毕业论文中文摘要金雀异黄素)和高搪+不同浓度金雀异黄素组(分别5、10、50、100、200umol/1)，培养12、24、48小时。半定量RT一PCR法检测金雀异黄素对SMemb mRNA、MMP一2mRNA、TIMP一1 mRNA表达的影响，ELISA法检测细胞培养液上清Fn分泌情况，明确量效关系，流式细胞仪进一步检测MC内PTK活性的变化，并确认其与上述物质表达量的相关关系。体内实验建立实验性DM大鼠模型，将大鼠分为正常对照组、DM组、DM+GEN灌胃组，分别于4周、8周末处死大鼠，留取血、尿标本及肾组织。常规生化法检测大鼠肾功能、血脂、血糖，ELISA法测定尿白蛋白浓度，计算尿白蛋白排泄率，放免法检测胰岛素水平，HE染色进行肾脏病理分析，采用RT一PCR法测定肾组织内SMemb mRNA、MMP一2 mRNA、TIMP一1 mRNA的表达水平，ELISA法检测肾组织匀浆中Fn分泌量，免疫组化法观察肾组织内MMP一2、T工MP--l表达强度。结果: 1.体外实验: RT~PCR实验结果显示，含6%血清的高糖DMEM组大鼠MC可表达SMemb mRNA，金雀异黄素可浓度、时间依赖性的下调其表达。ELISA法检测Fn的含量表明，高糖组与低糖组相比Fn的分泌显著增加，具有时间依赖性关系，金雀异黄素可浓度依赖性地抑制高搪刺激下MCFn的分泌。RT一PCR检测结果显示，与低糖组相比，高糖可抑制MMP一2 mRNA表达，促进TIMP一1 mRNA表达;加入金雀异黄素后可逆转高糖对MMP一2 mRNA表达的抑制作用，仅具有浓度依赖效应;但它可以浓度、时间依赖性地抑制TIMP一1 mRNA的表达;进一步比较金雀异黄素对MMP一2mRNA/T工MP一1 mRNA比值的影响，发现高糖可下调MMP一2 mRNA/TIMP一1 mRNA的水平，金雀异黄素可浓度时间依赖性地上调其比值。流式细胞仪检测MC内PTK活性结果显示低糖组PTK相对表达量较低，高糖组明显增加，具有时间依赖性，金雀异黄素可减少MC内PTK的相对表达量，低浓度(5、10umol/1)时PTK的相对表达量下降较弱，随浓度增高作用逐渐增强。进一步比较PTK活性与SMemb mRNA、枷P一2 mRNA/T工MP一1 mRNA水平以及细胞上清液中Fn分泌量之间的相关性表明:PTK活性与SMemb、Fn分泌量之间具有正相关关系，但与咖P一2 mRNA/TIMP一1 mRNA之间不具有负相关关系。 2.体内实验:第_军医人学2001级硕卜毕业论文中文摘要 SD大鼠血糖检测结果提示，通过STZ腹腔注射成功建立DM大鼠模型，DM大鼠的血糖明显高于正常对照组，而胰岛素敏感指数则显著降低，给予金雀异黄素则可改善高血糖状态，增加胰岛素敏感性。各组大鼠肾功能及尿白蛋白排泄率的检测结果提示DM组大鼠的尿素氮、肌醉、尿白蛋白排泄率显著高于正常对照组，外源性给予金雀异黄素可以保护肾功能，减少尿白蛋白排泄率。随时间延长，DM组大鼠血脂有所升高，加入金雀异黄素后在实验周期内可以显著降低血清胆固醇水平。病理观察发现，随时间延长DM组大鼠肾小球体积增大伴硬化、部分坏死、球囊粘连，肾小管空泡变性，肾小动脉壁增厚伴玻璃样变;外源性金雀异黄素可减轻肾小球肥大，肾小管及小动脉损伤。RT一PCR检测发现，金雀异黄素灌胃可以减少DM大鼠肾小球局部SMemb的表达。金雀异黄素尚可从蛋白水平

全文目录

英文缩写词表  6-8
中文摘要  8-11
English Abstract  11-14
前言  14-16
体外实验  16-18
  一、 SD大鼠肾小球系膜细胞株  16
  二、实验材料和试剂  16
  三、试剂与配制  16-17
  四、实验仪器  17-18
实验内容  18-45
  第一部分金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC表型转换标志物的影响  18-25
    一、方法  18-20
      (一) RT-PCR方法检测MC SMemb mRNA的表达  18-19
      (二) 统计分析  19-20
    二、结果  20-22
    三、讨论  22-25
  第二部分金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC细胞外基质合成和降解的影响  25-37
    一、方法  25-26
      (一) ELISA方法检测培养液中Fn的变化  25
      (二) RT-PCR方法检测MC MMP-2／TIMP-1 mRNA的表达  25-26
      (三) 统计分析  26
    二、结果  26-34
    三、讨论  34-37
  第三部分金雀异黄素发挥作用的可能机制探讨  37-45
    一、方法  37
      (一) 流式细胞仪检测PTK的表达  37
      (二) 统计分析  37
    二、结果  37-42
    三、讨论  42-45
体内实验  45-47
  一、动物  45
  二、实验材料和试剂  45
  三、实验仪器  45-47
实验内容  47-83
  第一部分金雀异黄素对DM大鼠肾重／体重变化、肾功能、尿白蛋白排泄率的影响  47-53
    一、方法  47-48
      (一) 肾重／体重测定  47
      (二) 肾功能测定  47
      (三) 尿白蛋白排泄率测定  47-48
      (四) 统计分析  48
    二、结果  48-51
    三、讨论  51-53
  第二部分金雀异黄素对DM大鼠血脂、血糖、胰岛素敏感性的影响  53-60
    一、方法  53
      (一) 血脂、血糖测定  53
      (二) 胰岛素敏感性测定  53
      (三) 统计分析  53
    二、结果  53-57
    三、讨论  57-60
  第三部分金雀异黄素对DM大鼠肾脏病理的影响  60-67
    一、方法  60
      (一) HE染色切片的制作  60
      (二) HE病理中球囊比计算  60
      (三) 统计分析  60
    二、结果  60-65
    三、讨论  65-67
  第四部分金雀异黄素对DM大鼠肾小球局部SMemb表达的影响  67-71
    一、方法  67-68
      (一) RT-PCR法检测SMemb mRNA在大鼠肾皮质内的表达  67-68
      (二) 统计分析  68
    二、结果  68-69
    三、讨论  69-71
  第五部分金雀异黄素对DM大鼠Fn、MMP-2／TIMP-1表达的影响  71-83
    一、方法  71-72
      (一) ELISA法检测肾组织匀浆Fn  71
      (二) 免疫组化法检测MMP-2／TIMP-1在大鼠肾皮质组织内的分布  71
      (三) RT-PCR方法检测肾皮质MMP-2／TIMP-1 mRNA的表达  71-72
      (四) 统计分析  72
    二、结果  72-81
    三、讨论  81-83
全文总结  83-84
参考文献  84-89
在读期间发表的论文与参编专著  89-90
文献综述  90-104
致谢  104

金雀异黄素对系膜细胞表型转换和细胞外基质作用的实验研究

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