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pIRES-GFP-hPENK的构建及其鞘内注射的表达

作　者: 李永辉
导　师: 涂心明；臧卫东
学　校: 河南科技大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 镇痛人前脑啡肽原基因膜片钳鞘内注射绿色荧光蛋白
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的疼痛的基因治疗被认为是一种安全有效的治疗手段,也是目前疼痛治疗的研究热点,其中目的基因和载体的选择是关键环节。脑啡肽(ENK)是内源性阿片肽的一种,与其他阿片类物质相比较,它在镇痛方面的诸多优越性已得到证实。前脑啡肽原基因(PENK)作为脑啡肽表达的调控基因,也成为慢性疼痛基因治疗的一种相对理想的基因选择。病毒载体携带PENK转染细胞或直接注射表达ENK为基因镇痛常用研究手段,但病毒的自我复制功能和人体的抗病毒免疫反应使其临床应用受到限制。因此,为进一步研究PENK及由其调控合成的ENK,本实验构建了高效、低毒、低免疫原性的真核表达质粒pIRES-GFP-hPENK,并进行了两方面的实验。体外实验通过转染NIH3T3细胞,取其上清液作用于神经元细胞,观察其表面钾离子通道的变化;体内试验通过将重组质粒注射入大鼠的蛛网膜下腔,观察该质粒的表达部位、时效及其产物ENK的表达,为镇痛基因研究和临床应用提供更加充足的实验资料。方法1.真核表达质粒pIRES-GFP-hPENK的构建重组质粒T-hPENK经PCR扩增目的基因,电泳后胶回收目的基因同相应双酶切的pIRES-GFP载体大片段连接,转入E.coli JM109菌株,用Amp筛选,挑选阳性菌落,提取质粒,双酶切鉴定。2.体外实验重组质粒pIRES-GFP-hPENK转染NIH3T3细胞,经过筛选阳性克隆得到稳定转染细胞系,取其上清液加入同步培养的原代神经元,应用膜片钳技术检测神经元细胞膜上K离子通道的变化。3.体内实验将重组质粒pIRES-GFP-hPENK注射入大鼠蛛网膜下腔,观察其在体内转染后的时空效应和其产物的作用。A组观察转染时空效应:雄性SD大鼠共35只,实验组(n=21)分为7个亚组(24小时、1、2、3、4、5、6周组各3只),对照组14只不做任何处理;B组观察产物作用:雄性SD大鼠共24只,实验组分为4个亚组(1、2、3、4周组各3只) ,对照组12只不做处理。实验组向蛛网膜下腔注射相应质粒100μl(浓度为30μg/100ml)。采用免疫组化技术观察绿色荧光蛋白和ENK的表达。结果1.真核表达质粒pIRES-GFP-hPENK成功构建,测序结果与GenBank报道的序列完全吻合,并转染至NIH3T3细胞得到表达。2.转染了新构建质粒的NIH3T3细胞分泌ENK至上清液中,膜片钳检测显示ENK能引起神经元胞膜上K外流增加。3.鞘内注射重组质粒pIRES-GFP-hPENK 24小时后得到表达,在脑膜、脊神经外膜上观察到绿色荧光,第7~14天达到高峰,第4周时下降明显,6周时消失。与实验组比较,对照组未发现绿色荧光。实验组也未发现大鼠脊髓神经损伤和动物行为学的改变。4.免疫组化结果显示实验组各时间点ENK的表达量明显高于对照组(P<0.01),且在2周时最高(P<0.01),4周时明显下降(P<0.01)。结论1. pIRES-GFP-hPENK转染细胞后的产物ENK可以引起神经元膜表面K离子外流增加。2.鞘内注射重组质粒pIRES-GFP-hPENK可转染至脑膜和脊神经外膜,外源基因调控的ENK表达长至四周。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-8
第1章综述  8-19
  1.1 ENK 的来源和分布  8-9
  1.2 ENK 的镇痛机制  9-11
  1.3 临床应用  11-18
  1.4 结语  18-19
第2章引言  19-21
第3章材料与方法  21-36
  3.1 材料  21-22
  3.2 常用试剂  22-23
  3.3 仪器设备  23-24
  3.4 方法  24-35
  3.5 统计分析  35-36
第4章结果  36-38
  4.1 目的基因扩增后电泳图  36
  4.2 重组质粒 pIRES-GFP-hPENK 酶切电泳图  36
  4.3 pIRES-GFP-hPENK 转染 NIH3T3 细胞结果  36
  4.4 膜片钳结果  36-37
  4.5 鞘内注射重组质粒 pIRES-GFP-hPENK 在大鼠体内转染的结果  37
  4.6 免疫组织化学结果  37-38
第5章讨论  38-41
  5.1 基因镇痛  38-39
  5.2 膜片钳技术在基因治疗中应用  39-40
  5.3 鞘内注射pIRES-GFP-hPENK 的表达  40-41
第6章结论  41-42
参考文献  42-47
缩略语词汇表  47-48
附录A 附录图表  48-52
致谢  52-53
攻读硕士学位期间的研究成果  53

pIRES-GFP-hPENK的构建及其鞘内注射的表达

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