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重组蛋白PTD-OD-HA在慢性粒细胞白血病模型小鼠的体内效应研究

作　者: 季茂胜
导　师: 冯文莉
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 慢性粒细胞白血病 OD域 BCR/ABL蛋白 动物模型
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 23次
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内容摘要


慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemian,CML)是一种起源于异常多能造血干细胞的克隆增殖性疾病,其发病的根本原因是具有强烈的酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白激活了多条信号转导通路,从而导致血细胞的恶性转化[1-2]。而该蛋白N-端寡聚化区域(oligomerization domain ,OD)是介导BCR/ABL同源寡聚化导致BCR/ABL自身磷酸化,使酪氨酸激酶异常激活的重要因素[3]。我们采用制备包含OD域的PTD-OD-HA融合蛋白,将其转入CML细胞,通过竞争性与BCR/ABL的OD域结合,阻止其同源寡聚化从而抑制BCR/ABL激酶活性的策略,进而达到治疗白血病的目的[4-6]。在课题组前期已通过原核表达并纯化了PTD-OD-HA融合蛋白,并在体外细胞实验中证明了其具有促进白血病细胞凋亡和抑制增殖的作用的基础上,本实验进一步研究PTD-OD-HA融合蛋白对慢性粒细胞白血病模型小鼠的体内效应。其主要实验方法、结果及结论如下:1.重组蛋白PTD-OD-HA对BaF3-P210细胞移植瘤模型小鼠致瘤能力的影响分别通过尾静脉注射小鼠BCR-ABL转化细胞BaF3-P210和PTD-OD-HA融合蛋白预处理的BaF3-P210细胞于BALB/C小鼠,构建白血病成瘤组模型和预防组模型。另外将未经任何处理的BALB/C小鼠设为正常对照组。观察细胞移植后小鼠的生长状况、体重、外周血白细胞计数、外周血和骨髓涂片瑞氏染色细胞形态学;处死小鼠后摘除各脏器,观察各组小鼠脏器是否有肿大、出血点等变化,并做组织切片HE染色观察组织的病理变化和是否有白血病细胞浸润,收集小鼠骨髓细胞western blot检测BCR/ABL的表达水平。最后制作小鼠的生存曲线判断小鼠的生存率变化。成瘤组小鼠3周时出现双后肢拖行、体重进行性下降、外周血白细胞计数进行性升高等白血病的表现,外周血、骨髓涂片染色发现白血病细胞增多;解剖发现脾脏明显增大,病理组织学检查发现肝细胞索紊乱并有大量的白血病细胞浸润,脾结节紊乱并有白血病细胞浸润。而PTD-OD-HA预防组小鼠仅在注射后第5周部分小鼠出现体重略微下降,外周血、骨髓涂片染色亦发现白血病细胞增多;肝脏、脾脏未见增大,病理组织学检查见肝细胞索、脾结节轻微紊乱,仅见轻微的白血病细胞浸润。western blot检查观察到成瘤组小鼠骨髓细胞高表达BCR/ABL癌蛋白,而该蛋白在预防组小鼠为弱表达。通过生存曲线观察到预防组小鼠的生存期比成瘤组明显延长。通过以上结果证实:BaF3-P210细胞经过PTD-OD-HA融合蛋白预处理后可以明显降低其致白血病的潜能,降低外周血、骨髓中白血病细胞的数量,减少脏器浸润,延长CML小鼠的生存期。2. PTD-OD-HA融合蛋白对白血病K562细胞裸鼠皮下实体瘤模型的治疗作用在BALB/C裸鼠皮下注射一定量的对数生长期K562细胞后,构建白血病皮下实体瘤模型。皮下多点注射PTD-OD-HA融合蛋白后(每两天注射一次200uL浓度为10mg/mL的蛋白)观察小鼠瘤体积的变化、组织切片HE染色的病理变化、透射电镜和TUNEL实验原位检测细胞凋亡,免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达情况。与未经治疗的K562细胞成瘤组相比,经过PTD-OD-HA融合蛋白治疗的皮下瘤体积增长速度明显减慢,肿瘤体积较小;病理组织切片表现出细胞核浓缩、细胞染色加深等凋亡的改变;TUNEL原位凋亡检测也观察到绿色荧光明显增强,即有大量细胞发生凋亡的改变。透射电镜检测到肿瘤细胞发生线粒体轻微肿胀和产生凋亡小体等凋亡现象。免疫组化检测到Bcl-2表达降低,Bax表达升高。结果证实:PTD-OD-HA融合蛋白具有抑制K562细胞裸鼠皮下实体瘤增长、促进其发生凋亡,并改善小鼠生存状态的作用。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-17
第一部分 重组蛋白PTD-OD-HA 对BaF3-P210 细胞移植瘤模型小鼠致瘤能力的影响  17-29
  1 材料和方法  17-22
  2 结果  22-26
  3 讨论  26-29
第二部分PTD-OD-HA 融合蛋白对白血病K562 细胞裸鼠皮下实体瘤模型的治疗作用  29-36
  1 实验材料和方法  29-32
  2 结果  32-33
  3 讨论  33-36
全文总结  36-37
参考文献  37-39
附图  39-44
文献综述  44-49
  参考文献  47-49
致谢  49-50
攻读硕士学位期间发表的文章  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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