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初步建立作用于人CXCR4启动子药物的筛选方法

作　者: 马云云
导　师: 赵国强
学　校: 郑州大学
专　业: 免疫学
关键词: CXCR4启动子药物筛选抗艾滋病药物报告基因
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景和目的获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的。HIV进入CD4~+细胞是通过病毒的衣壳糖蛋白、CD4受体与趋化因子受体之间相互作用而完成的。CD4分子是HIV-1感染宿主细胞的主要受体,可是,在HIV病毒感染的过程中,都需要有辅助受体与CD4协同作用。CXCR4(CXC-chemokine receptor4,CXCR4)作为第一个被发现的辅助受体,主要分布在机体的免疫细胞表面,属七次跨膜的G蛋白偶联膜受体,与CXCR1-CXCR6、CCR1-CCR11、XCR1和XCR2等同属于趋化因子受体家族。HIV病毒在感染宿主细胞过程中,病毒表面的糖蛋白gp120先与细胞表面CD4受体结合,吸附于宿主细胞上,然后gp120再与辅助受体(CXCR4或CCR5)相互作用,病毒进一步接近宿主细胞,病毒表面跨膜蛋白gp41构象发生变化,导致病毒包膜与宿主胞膜融合,病毒的RNA进入细胞。近年来,针对于病毒吸附与穿入环节的抗HIV药物成为研究的热点。中药作是我国独特的药物资源宝库,种类繁多,作用各异,其中是否存在能影响CXCR4启动子的活性、降低CXCR4的表达,从而起到预防、治疗AIDS的药物,是值得进一步研究的问题。为此,本实验拟建立一种方法,筛选作用于CXCR4启动子的具有潜在抗HIV/AIDS作用的中药。我们先将CXCR4启动子片段克隆到pGL4载体上,再将构建好的带有CXCR4启动子的萤光素酶报告基因转染入急性淋巴瘤细胞(Jurkat细胞),利用载体上的筛选标记neo基因,用G418筛选得到稳定转染克隆。然后选取13种中药分别给大鼠连续灌胃七天后采血,分离出含药血清刺激转染细胞株,通过检测报告基因萤光素酶的活性,判断这些中药对CXCR4启动子转录作用的影响,建立作用于HIV辅助受体CXCR4启动子的抗HIV/AIDS药物体外筛选方法。方法设计并合成扩增CXCR4启动子的引物,从含有CXCR4启动子序列的pUC-CXCR4质粒中PCR扩增CXCR4的启动子基因序列;将CXCR4启动子基因片段克隆入T载体(pGEM-T-CXCR4),再亚克隆进pGL4萤光素酶报告载体,PCR、双酶切筛选阳性重组子,并进行DNA序列测定,得到pGL4-CXCR4;脂质体包裹转染pGL4-CXCR4入Jurkat细胞(急性T淋巴细胞白血病细胞),G418筛选得到稳定转染细胞株,扩大培养后分组;使用13种中药煎剂(黄芩、黄连、黄柏、金银花、连翘、半边莲、鱼腥草、大青叶、板蓝根、灵芝、穿心莲、猪苓、甘草),分别给成年Wistar大鼠连续灌胃7天后采血,分离含药血清;将13种含药血清分别作用于各组稳定转染细胞后,通过检测报告基因萤光素酶活性反映各含药血清对CXCR4启动子的作用。结果数据用统计学软件SPSS13.0分析。结果1.PCR扩增CXCR4启动子基因片段,电泳可见777bp处有明亮条带,与设计一致。2.将CXCR4启动子基因片段与pGEM-T Easy连接后,转化DH5α,筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-CXCR4。3.将CXCR4启动子基因片段亚克隆入萤光素酶报告基因载体pGL4,得到萤光素酶报告质粒pGL4-CXCR4。PCR扩增及双酶切鉴定证明插入序列正确,DNA序列测序,结果与设计完全一致。4.G418筛选得到稳定转染pGL4-CXCR4细胞株。5.萤光素酶活性检测:黄柏组细胞的萤光素酶萤光值为406175.2±35146.2,鱼腥草组为612186.8±38890.9,与对照组萤光值869159.0±62618.8相比,显著降低(P＜0.05);半边莲组细胞的萤光素酶萤光值为1146839±106138.3,较对照组显著升高(P＜0.05)。结论1.构建CXCR4启动子的萤光素酶报告基因载体,应用血清药理学方法,建立起作用于CXCR4启动子药物的体外筛选方法。2.黄柏和鱼腥草可降低体外培养细胞中CXCR4启动子的活性,可能具有潜在的抗HIV/AIDS作用,值得进一步的实验证实。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-10
论文题目初步建立作用于人CXCR4启动子药物的筛选方法  10-38
  前言  10-12
  1 实验材料  12-16
  2 实验方法  16-26
  3 结果  26-30
  4 讨论  30-34
  5 小结  34-35
  参考文献  35-38
综述趋化因子CXCL12及其受体CXCR4的研究进展  38-56
  参考文献  52-56
中英文专业词汇对照  56-57
致谢  57

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