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基于抗氧化作用的心血管药物先导化合物活性筛选与评价

作　者: 张羽钦
导　师: 朱海波；李学勇；田金英
学　校: 北京协和医学院
专　业: 药理学
关键词: 氧化应激 心血管创新先导化合物 心肌缺血/再灌注损伤 高脂血症
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


心血管疾病是目前人类生命健康的头号杀手,包括心肌缺血/再灌注损伤,高脂血症以及动脉粥样硬化等。在众多发病机制的学说中,活性氧(Reactive Oxygen Spices, ROS)产生过多导致细胞氧化应激性损伤被认为是上述疾病的始动因素。大量流行病学研究表明,无论是心肌缺血/再灌注损伤,还是高脂血症,氧化应激均是两种疾病的共同发病机制。以抗氧化损伤为切入点筛选和评价心血管药物先导化合物,是本课题的研究内容。本文分为以下两个部分,其一,对从丹参中分离出的6个水溶性化合物：丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素和原儿茶醛进行体外分子水平氧自由基清除活性筛选,发现丹酚酸A自由基清除活性最强。因此选择丹酚酸A进行心肌缺血/再灌注损伤保护作用研究；其二,对我所合成的7个天然产物衍生物——新结构化合物WS070035、WS070117、WS070120、WS070121、WS070124、WS070135和WS070143进行体外分子水平氧自由基清除活性筛选,发现WS070117有显著的清除自由基作用,因此本文选择WS070117作为目标化合物进行抗脂质过氧化损伤研究。在第一部分实验中,采用体外分子水平自由基清除活性评价体系分别以比色法、荧光法和化学发光法评价受试品丹酚酸A对五种自由基和过氧化氢的清除作用。结果表明,丹酚酸A对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基、过氧自由基、过氧化氢和过氧化亚硝酸盐均具有显著的清除作用,其活性强度为：DPPH>过氧自由基>羟自由基>过氧化氢>过氧化亚硝酸盐>超氧阴离子。在上述实验基础上,本文在细胞水平进一步探讨丹酚酸A对低氧/复灌诱导心肌细胞损伤保护作用。选择大鼠胚胎心肌细胞系H9c2作为模式材料,采用数字化低氧复灌系统,1%O2低氧12小时、复灌8小时造成氧化应激性损伤。阳性对照药Tempo在100μmol/L浓度下有明显提高细胞存活率和线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP,ΔΨm)、降低细胞内活性氧水平的作用；丹酚酸A在0.001、0.01、0.1、1和10μmol/L浓度下,细胞存活率明显提高；在0.01、0.1和1μmol/L浓度下,丹酚酸A则明显抑制低氧/复灌诱导的细胞内自由基水平升高和线粒体膜电位降低,提示丹酚酸A可通过抗氧化作用对低氧/复灌诱导心肌细胞损伤具有保护作用。在离体器官水平通过停灌20分钟——再灌注1小时损伤模式建立大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型,观察丹酚酸A对离体心脏的保护作用。结果发现,再灌注后心脏冠脉流量、左心室内压最大上升速率和左心室内压最大下降速率均显著下降,左心室舒张末压明显上升,表明冠脉舒张功能和左心室舒缩功能均受到损害。单次给予不同浓度丹酚酸A(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μmol/L)后,上述四项指标均得到了显著改善。本实验在分子、细胞和离体器官三个水平的结果均证实,丹酚酸A可通过抗氧化作用发挥其对心肌缺血/再灌注损伤保护作用,此结论在本实验室杨柳同学大鼠和比格犬心肌缺血/再灌注性损伤体内实验得到了进一步证实。在第二部分实验中,对我所合成的七个新结构类型化合物进行体外分子水平自由基和过氧化氢清除活性筛选,发现化合物WS070117清除自由基活性最强。细胞水平实验结果证实,WS070117在100、10、1、0.1和0.01μmol/L浓度下可明显抑制TNF-α诱导HepG2细胞内自由基水平的升高；化学发光检测结果提示,WS070117对NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)活性可能有抑制作用。在整体动物实验中,采用高脂饲料诱导的、他汀类药物无法降低血脂的、具有明显脂质过氧化损伤的极高血脂型apoE-/-小鼠模型,观察WS070117独立于降脂以外的整体动物抗氧化作用,与正常对照组相比,极高血脂apoE-/-小鼠模型组肝脏和动脉活性氧产生明显增加,动脉粥样硬化斑块大量堆积；肝脏和血清中的脂质过氧化物丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量显著升高,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性明显降低。连续给予WS070117(5mg/kg),与模型组相比,WS070117给药组肝脏和动脉活性氧水平下降,动脉粥样硬化斑块明显减小；肝脏和血清中MDA含量显著降低,SOD活性显著性升高。表明WS070117对脂质过氧化损伤具有明显的保护作用。上述结果提示,体外分子水平自由基清除实验是寻找具有抗氧化作用的脂溶性化合物的可行的筛选方法；保护脂质过氧化损伤作用可能是本实验室连泽勤、高健和姜微哲同学发现的WS070117治疗金黄地鼠和大鼠高脂血症的重要机制；化合物WS070117可能是潜在的治疗高脂血症的新型化合物类型。本文以抗氧化损伤为切入点,分别在实验性心肌缺血/再灌注损伤和脂质过氧化损伤两种疾病模型上发现水溶性丹酚酸A和脂溶性WS070117在抗心肌缺血和调血脂两方面具有心血管保护作用。本文的实验结果再次证实氧化损伤是心肌缺血及高脂血症等疾病的重要发病因素,以此作为药物筛选的评价指标有可能是寻找新型心血管保护作用重要药物的发现手段之一。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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