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蛋白酶胁迫下线虫的体壁覆盖层蛋白组学分析

作　者: 黄薇
导　师: 黄建忠；田宝玉
学　校: 福建师范大学
专　业: 发酵工程
关键词: 植物寄生线虫侧孢短芽孢杆菌生物防治侵染性蛋白酶基因敲除抗性差异线虫体壁粘液层蛋白(SCPs) 差异蛋白质组学 MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胞外蛋白酶长久以来一直被认为是杀线虫微生物侵染线虫过程中的一个重要毒性因子,这些酶大多属于丝氨酸蛋白酶家族的枯草蛋白酶类。研究表明,它们在促进微生物穿透线虫体壁屏障,侵入宿主体内等方面起着至关重要的作用。本论文从来源于杀线虫细菌侧孢短芽孢杆菌G4的一个侵染性丝氨酸蛋白酶BLG4入手,研究了细菌在侵染线虫过程中分泌的侵染性蛋白酶与线虫的保护屏障体壁粘液层蛋白之间的相互作用,试图阐释酶对线虫的降解及线虫本身的自我防护机制,为将来开发植物寄生线虫的生防策略提供新的思路和理论基础。已有的组织病理学和组织免疫学研究已表明侵染性丝氨酸蛋白酶BLG4是侧孢短芽孢杆菌侵染线虫过程中的一个重要病理因子。本研究首先构建了侧孢短芽孢杆菌BLG4基因缺失突变株进一步在分子水平上来验证侵染性蛋白酶的作用。将蛋白酶BLG4基因片段插入重组载体,成功得到整合载体pUC19SB,电转化将pUC19SB转入侧孢短芽孢杆菌G4感受态,利用单交换同源重组的原理构建了BLG4基因突变株(G4△BLG4)。结果表明缺失菌株G4△BLG4的体壁降解能力和杀线虫活性同比野生菌株急剧下降。另外,体外生测也表明蛋白酶浓度与线虫的致死率之间存在着明显的剂量-效应相关性,24h时的半致死浓度LC50为1.0694μg/mL。生化与显微检测线虫在酶胁迫条件下的抗性反应结果表明,不同处理条件下线虫对蛋白酶的降解存在明显的抗性差异。活的线虫对蛋白酶BLG4的降解存在明显的抗性,而经过热杀死的线虫更容易被酶破坏和消解,这同先前组织免疫结果相一致,酶对线虫体表不同部位的结合能力不同,提取的线虫体壁和死的线虫更容易被酶攻击。结果证明线虫自身存在着一种有效的抗性机制可以抵抗酶对线虫体壁的攻击。先前曾有报道线虫体壁粘液层作为角质膜的最外层,在线虫防止外源病原侵害以及免疫逃逸机制方面起着非常重要的作用。因此,鉴定和分析侵染性蛋白酶在降解线虫体壁过程中相关的线虫体壁粘液层蛋白(surface coat proteins, SCPs),研究蛋白酶BLG4与线虫SCPs之间的相互作用,对于阐释酶对线虫的降解及线虫本身的自我防护机制具有极其重要的意义。本研究于是进一步通过对比和分析多种不同的蛋白提取沉淀方法,建立了一套适合线虫SCPs的样品制备技术,即采用35%乙醇法提取蛋白,TCA-丙酮法浓缩蛋白；及双向电泳分离体系：用11cm,pH=3～10胶条等电聚焦6000V、4000vh结合12%的SDS-PAGE进行双向电泳分离。在上述技术体系基础上,利用差异蛋白质组学方法,研究了蛋白酶BLG4胁迫下线虫SCPs的表达变化。经过仔细对比和分析,从2-DE凝胶共切取了27个差异蛋白质斑点,经过质谱鉴定和数据检索得到匹配的蛋白质14个。除去5个未知假设蛋白,共得到了9个分别与防御/免疫、糖酵解过程、生物合成、能量代谢等途径有密切相关的蛋白质。进一步深入研究这些差异蛋白质将为阐明丝氨酸蛋白酶BLG4降解线虫体壁的分子机理提供理论依据。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-11
绪论  11-25
  第一节植物寄生线虫的生物防治  11-14
    1.1 食线虫真菌  11-12
    1.2 食线虫细菌  12-14
    1.3 植物寄生线虫生物防治中存在的问题  14
  第二节线虫体壁降解蛋白酶  14-17
    2.1 体壁降解蛋白酶的发现及研究历史  15-16
    2.2 体壁降解蛋白酶的结构特征  16-17
  第三节线虫体壁覆盖层蛋白(SCPs)  17-21
  第四节蛋白质组学及其在线虫研究的应用  21-24
    4.1 蛋白质组学  21-23
    4.2 差异蛋白质组学  23
    4.3 线虫差异蛋白质组学研究进展  23-24
  第五节本研究的内容和意义  24-25
第1章蛋白酶BLG4基因的缺失及功能验证  25-39
  第一节材料与方法  25-30
    1.1 材料  25-26
    1.2 方法  26-30
  第二节结果与分析  30-37
    2.1 BLG4基因敲除组件pUC19SB的构建与验证  30-31
    2.2 BLG4基因突变体的构建  31-32
    2.3 缺失突变子的筛选与验证  32-35
    2.4 侧孢短芽孢杆菌蛋白酶BLG4突变株的生长及生理生化特性  35-36
    2.5 突变株杀线虫活性和体壁降解测试  36-37
  第三节小结与讨论  37-39
第2章侵染性蛋白酶BLG4对线虫的致病性及作用差异性研究  39-49
  第一节材料与方法  39-42
    1.1 材料  39-40
    1.2 方法  40-42
  第二节结果与分析  42-46
    2.1 细菌蛋白酶BLG4的纯化与定量  42-43
    2.2 蛋白酶BLG4对线虫的毒性效应  43-44
    2.3 蛋白酶对线虫体壁的破坏  44-45
    2.4 不同处理线虫对酶解抗性的差异性研究  45-46
  第三节小结与讨论  46-49
第3章线虫体壁覆盖层蛋白(surface coat proteins,SCPs)提取及质量评价  49-59
  第一节材料与方法  49-54
    1.1 材料  49-52
    1.2 方法  52-54
  第二节结果与分析  54-57
    2.1 不同提取方法对线虫SCPs提取的影响  54-55
    2.2 不同浓缩方法对线虫SCPs样品制备的影响  55-56
    2.3 线虫SCPs对BLG4蛋白酶活性的影响  56-57
  第三节小结与讨论  57-59
第4章蛋白酶BLG4胁迫下线虫SCPs的差异蛋白质组学研究  59-75
  第一节材料与方法  59-65
    1.1 材料  59-62
    1.2 方法  62-65
  第二节结果与分析  65-72
    2.1 线虫SCPs双向电泳体系的建立  65-66
    2.2 酶胁迫与非胁迫双向电泳图谱比较  66-67
    2.3 差异蛋白质的质谱鉴定  67-72
  第三节小结与讨论  72-75
第5章结论  75-77
参考文献  77-83
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  83-85
致谢  85-87
个人简历  87-89

蛋白酶胁迫下线虫的体壁覆盖层蛋白组学分析

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