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家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因

作　者: 周阳
导　师: 陈克平
学　校: 江苏大学
专　业: 食品科学
关键词: 家蚕核型多角体病毒 Bm5 基因敲除 基因芯片 BmNPV抗性 差异表达基因 荧光定量PCR
分类号: S884.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


家蚕是重要的经济昆虫,也是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)的天然宿主。家蚕核型多角体病毒是引起家蚕病毒严重感染的关键病原之一,病毒与宿主的相互博弈一直是研究者们关注的问题。家蚕抗NPV机制至今尚未完全明确,但究其病因可归因于宿主与致病病毒两方面因素。本研究以BmNPV核心基因Bm5为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位和基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能。同时使用家蚕高密度Oligo表达谱芯片所提供了相关基因的基因组学的证据,突破了以往单个基因孤立研究的局限,在全基因组范围内筛选家蚕抗NPV相关基因,对筛选出基因进行GO和Pathway分析,并进一步用半定量PCR和荧光定量PCR进行验证,探讨家蚕抗NPV的途径和机理。论文主要结论如下：1.BmNPV的orf5(Bm5)位于基因组4,605--5,600 nt,全长993 bp,编码一个含331个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为39.3 kDa,Bm5是AcMNPV orf13的同源序列。在Bm5基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA,暗示了该基因是晚期表达基因。根据Bm5基因序列设计引物,分别以BmNP基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a(+),在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BM5蛋白的多克隆抗体。2. RT-PCR分析发现,Bm5在病毒感染宿主细胞12 h开始转录,直到72 h。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm5的表达产物在病毒感染宿主细胞后24 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为39.3kDa,与预测的大小一致,说明Bm5是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子,表明BM5不是病毒粒子的结构蛋白。利用抗体检测发现BM5定位在细胞质中。3.利用Red重组系统在大肠杆菌中成功地对BmNPV的Bm5基因进行了快速定点敲除。并BmNPV/Bac-to-Bac系统和Red重组系统结合在一起,对敲除了Bm5基因的BmNPV:进行了拯救。分别构建了野生型病毒vBm5-Wt、Bm5基因缺失病毒vBm5-Ko和Bm5基因拯救病毒vBm5-Re。4.应用基因芯片技术在家蚕抗NPV品系BC8、感性品系306中筛查抗性相关基因,结果发现93个差异表达基因其中表达上调基因44个,下调基因49个。GO分析表明93个基因中51个其中24个上调基因、27个下调基因具有功能注释。GO分析结果显示分子功能方面主要有酶活性、氧化还原活性、酶绑定、结构成分、转运活性等；生物进程方面主要有新陈代谢、蛋白质水解、电子转移、蛋白质定位、转移、蛋白质生物等功能；细胞组分方面主要有细胞内、膜核糖体、胞外区等。Pathway分析表明有新陈代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酸代谢、核糖体、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、糖酵解/糖异和柠檬酸循环(TCA循环)等通路。5.为了验证芯片筛选出差异表达基因,从93个差异基因挑选14个表达量差异大基因(9个上调基因、5个下调基因)进行RT-PCR,依据结果再从14个基因中挑选10个差异基因(7个上调基因、3个下调基因)进行荧光定量PCR。结果表明了7个上调基因中5个基因在NB、BC8各时间点的表达量高于306,鉴定为抗性相关上调基因,2个基因在BC8表达量高于NB、306。3个下调基因在306的表达量要高于NB、BC8,鉴定为抗性相关下调基因。表明荧光定量PCR试验结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-15
第一章 文献综述  15-59
  1.1 杆状病毒概述  15-31
    1.1.1 杆状病毒的分类  15
    1.1.2 杆状病毒的形态和结构  15-17
    1.1.3 杆状病毒的生活周期  17-18
    1.1.4 杆状病毒基因组研究进展  18-31
  1.2 昆虫和杆状病毒的相互关系  31-42
    1.2.1 昆虫抗病毒研究  31
    1.2.2 对病毒的遗传抗性  31-32
    1.2.3 对病毒感染的物理和生理屏障  32-34
    1.2.4 细胞免疫  34-36
    1.2.5 细胞凋亡  36-38
    1.2.6 体液免疫  38-42
  1.3 家蚕抗NPV的研究  42-50
    1.3.1 杆状病毒侵染昆虫的机理  42-43
    1.3.2 BmNPV的增殖曲线及病毒增殖与蚕体生理代谢的变化  43-45
    1.3.3 家蚕对BmNPV抵抗性的遗传规律研究  45
    1.3.4 家蚕中肠在抗NPV的作用  45-46
    1.3.5 家蚕抗BmNPV的相关基因  46-50
  1.4 基因芯片研究进展及应用  50-54
    1.4.1 芯片的发展及研究步骤  50-51
    1.4.2 芯片分类  51-53
    1.4.3 芯片的应用领域  53
    1.4.4 基因芯片技术在家蚕中的应用  53-54
  1.5 本研究的目的和意义  54-55
  1.6 主要研究内容和研究路线  55-59
    1.6.1 研究内容  55
    1.6.2 研究路线  55-59
第二章 Bm5基因序列分析、原核表达和多克隆抗体制备  59-73
  2.1 材料与方法  59-64
    2.1.1 材料  59-61
    2.1.2 方法  61-64
  2.2 结果与分析  64-70
    2.2.1 Bm5的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征  64-65
    2.2.2 BM5的氨基酸同源性分析  65-67
    2.2.3 Bm5的克隆  67-69
    2.2.4 Bm5基因的原核表达及检测  69
    2.2.5 BM5蛋白的纯化  69
    2.2.6 融合蛋白6×His接头的鉴定  69-70
  2.3 讨论  70-71
  2.4 小结  71-73
第三章 Bm5基因的转录、表达研究及表达产物的定位  73-81
  3.1 材料与方法  73-76
    3.1.1 材料  73-74
    3.1.2 方法  74-76
  3.2 结果  76-80
    3.2.1 Bm5的转录时相  76-77
    3.2.2 Bm5的表达时相  77-78
    3.2.3 BM5的亚细胞定位  78
    3.2.4 BM5蛋白在病毒结构中的定位  78-80
  3.3 讨论  80
  3.4 小结  80-81
第四章 家蚕核型多角体病毒Bm5的缺失和拯救  81-93
  4.1 材料和方法  81-87
    4.1.1 材料  81-82
    4.1.2 方法  82-87
  4.2 结果  87-92
    4.2.1 大肠杆菌菌株BW25113-Bac的获得  87
    4.2.2 Bm5基因打靶线性化片断的鉴定  87
    4.2.3 重组质粒pUC-US-Cm-DS的酶切鉴定  87-88
    4.2.4 Bm5缺失重组Bacmid的构建和验证  88-89
    4.2.5 vBm-wt、vBm5-ko和vBm5-re三种Bacmid的获得  89-92
  4.3 讨论  92
  4.4 小结  92-93
第五章 基因芯片的筛选抗BmNPV相关基因  93-111
  5.1 材料和方法  93-96
    5.1.1 材料  93
    5.1.2 试验方法  93-96
  5.2 结果  96-108
    5.2.1 RNA提取的浓度和纯度鉴定  96
    5.2.2 高密度家蚕Oligo芯片杂交结果  96
    5.2.3 芯片的图像处理及数据采集结果  96-99
    5.2.4 筛选差异基因  99-102
    5.2.5 GO分析结果  102-107
    5.2.6 Pathway分析  107-108
  5.3 讨论  108-109
  5.4 结论  109-111
第六章 部分差异基因的验证  111-129
  6.1 材料与方法  111-113
    6.1.1 实验材料  111-113
    6.1.2 实验方法  113
  6.2 结果与分析  113-122
    6.2.1 RT-PCR检测抗性相关基因  113-114
    6.2.2 QRT-PCR检测相关抗性基因  114-122
  6.3 讨论  122-128
    6.3.1 实时相对定量荧光RT-PCR技术  122-123
    6.3.2 验证材料的特异性  123
    6.3.3 验证差异基因的时间、空间特异性  123-124
    6.3.4 验证方法的特异性  124-125
    6.3.5 鉴定的基因功能分析  125-128
  6.4 结论  128-129
总结和展望  129-131
  总结  129
  展望  129-131
本研究创新点  131-133
参考文献  133-154
博士期间发表的研究论文和参加的课题  154-155
致谢  155

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕的病虫害及其防治 > 病毒病（脓病）
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