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梨S基因芯片的试制及分子杂交条件的初步研究

作　者: 江南
导　师: 谭晓风；陈洪
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 梨自交不亲和性 S基因型基因芯片寡核苷酸芯片分子杂交
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 28次
引　用: 1次
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内容摘要

梨是典型的配子体自交不亲和植物,自花授粉座果率低。梨自交不亲和性由单一基因位点的S复等位基因所控制。在梨栽培中,必须配置S基因型不同的授粉品种才能保证正常的授粉受精和丰产稳产,因此,确定梨品种的S基因型是梨栽培、育种(特别是杂交育种)的重要科学依据。我国梨品种S复等位基因丰富,目前只有少数品种的S基因型已被确定。现今国内外主要运用PCR-RFLP技术、DNA序列测定技术、cDNA克隆及序列分析方法等方法结合杂交授粉试验来确定S基因型,这些方法工作量大且检测单个样本的S基因型成本较高,自动化程度低。因此开发一种更有效、更直接、简化的方法,用于梨品种自交不亲和基因型的确定十分必要。应用寡核苷酸芯片技术鉴定梨品种或其他植物品种S基因型国内外尚未见报道。本实验针对梨S-RNase基因的结构特点选择性地设计了部分S-RNase特异的寡核苷酸探针试制成梨自交不亲和性基因型检测寡核苷酸芯片,并对运用寡核苷酸芯片技术检测梨品种S基因型进行了初步的方法学上的探索,主要研究结果如下：1.利用"FTQQYQ" (P1)和"anti-IIWPNV" (P2) Cy3荧光标记特异引物法分别对各品种的S基因片断进行PCR扩增,并纯化PCR产物,获得荧光标记的芯片检测的靶序列。2.根据GenBank及相关文献的数据资料,结合本实验室的研究成果,按照寡核苷酸探针设计原则选择性地设计了7条32mer特异的S基因寡核苷酸探针,探针合成时对5、端进行氨基修饰。3.以0.1M pH=9碳酸缓冲液作为点样液,调整探针的终浓度为100uM,将寡核苷酸探针手动点样在醛基玻片上,制成梨S基因寡核苷酸检测芯片,用已知S基因型的梨品种的扩增片段与芯片杂交,获得有效的杂交信号。4.为保证杂交的特异性,针对影响杂交信号的诸多因素从杂交时间、杂交温度及PCR产物浓度等方面对杂交体系进行了优化。实验结果表明,47℃条件下,100ng/μL的梨品种PCR产物与杂交液混合(PCR产物：杂交液：灭菌水=1：1：1)与芯片杂交4小时,可获得交好的杂交信号。5.用寡核苷酸芯片分别对黄花、桂冠、黄金、鲜黄、大核白等S基因型已知的梨品种进行检测,芯片信号扫描结果显示检测结果与各品种的已知基因型完全相符,各品种重复杂交2次。杂交结果完全一致,表明寡核苷酸芯片特异性好,芯片检测结果准确可靠。本实验的研究结果证明梨S基因寡核苷酸检测芯片检测梨品种所包含的S-RNase基因和基因型是一种切实可行的检测方法。如果进一步将所有S-RNase基因的特异性探针集中于芯片上的一个阵列,就能发挥基因芯片大量、快速、准确检测梨品种S基因型的重要作用,同时也为其他果树品种的基因研究提供一种新的思路。

全文目录

缩略词  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-13
1 绪言  13-35
  1.1 植物的自交不亲和性及其分子机理  13-17
    1.1.1 植物的自交不亲和性  13
    1.1.2 植物的自交不亲和性类型  13-14
    1.1.3 植物的自交不亲和性的分子机理  14-17
  1.2 梨自交不亲和性的研究进展  17-25
    1.2.1 梨自交不亲和性的分子生物学研究  17-22
    1.2.2 梨品种自交不亲和性S基因及基因型的研究方法  22-25
  1.3 应用基因芯片技术进行基因检测的研究进展  25-32
    1.3.1 生物芯片概述  25-26
    1.3.2 生物芯片的研究现状  26-28
    1.3.3 生物芯片的应用现状  28-32
  1.4 本研究的目的意义及研究路线  32-35
    1.4.1 目的意义  32-33
    1.4.2 技术路线  33-35
2 梨S基因寡核苷酸芯片的设计与制作  35-42
  2.1 梨S基因寡核苷酸芯片的设计与检测的基本原理  35
  2.2 寡核苷酸探针设计  35-38
    2.2.1 核酸探针的定义及种类  35-37
    2.2.2 探针设计的原则  37
    2.2.3 探针设计  37
    2.2.4 探针的合成  37-38
  2.3 S基因寡核苷酸芯片的制备  38-40
    2.3.1 基片的制备  38-39
    2.3.2 S基因寡核苷酸检测芯片制备  39-40
  2.4 实验结果及讨论  40-42
    2.4.1 设计的寡核苷酸探针序列  40
    2.4.2 寡核苷酸探针的性质  40-41
    2.4.3 小结与讨论  41-42
3 梨S基因检测芯片杂交条件的优化  42-53
  3.1 实验材料  42-43
    3.1.1 植物材料  43
    3.1.2 梨S基因芯片  43
    3.1.3 主要实验试剂  43
    3.1.4 主要仪器  43
  3.2 实验方法  43-45
    3.2.1 梨叶片基因组DNA提取  43-45
    3.2.2 基因组DNA的质量检测  45
  3.3 S基因特异PCR扩增与纯化  45-48
    3.3.1 PCR扩增引物  45-46
    3.3.2 S基因PCR产物的扩增  46-48
  3.4 S基因寡核苷酸检测芯片杂交条件优化  48-49
    3.4.1 杂交体系  48
    3.4.2 杂交实验步骤  48
    3.4.3 杂交结果检测  48-49
    3.4.4 杂交条件优化  49
  3.5 实验结果与讨论  49-53
    3.5.1 基因组DNA提取结果  49-50
    3.5.2 PCR扩增产物电泳检测  50
    3.5.3 杂交条件优化  50-52
    3.5.4 小结与讨论  52-53
4 应用梨S基因芯片检测梨品种S基因型  53-56
  4.1 材料方法  53-54
    4.1.1 实验材料  53
    4.1.2 实验仪器  53
    4.1.3 实验方法  53-54
  4.2. 结果与分析  54-56
    4.2.1 实验结果  54-55
    4.2.2 小结与讨论  55-56
5. 本研究的创新点和进一步研究的内容  56-57
  5.1 本论文的创新点  56
  5.2 进一步研究内容  56-57
参考文献  57-67
附录A 主要试剂的配制  67-69
附录B (攻读学位期间发表的学术论文)  69-70
致谢  70

梨S基因芯片的试制及分子杂交条件的初步研究

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