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间尼索地平(m-nisoldipine)是1,4-二氢吡啶类钙拮抗剂,存在一对光学异构体(R,S-m-nisoldipine),是河北医科大学药物化学教研室自行研制的用于治疗高血压的国家一类新药。二氢吡啶类药物为血管扩张性钙通道受体拮抗剂,在临床上广泛用于治疗缺血性心脑血管疾病、高血压等,且稳定性好,疗效显著。因此,开发与研制防治高血压的药物具有重要的社会意义。本实验旨在采用ES-OVM手性柱建立R,S-间尼索地平的拆分及含量测定方法,并研究R,S-间尼索地平在Beagle犬体内的药代动力学行为,通过对R,S-间尼索地平在大鼠体内的组织分布、在体肠吸收实验以及不同种属血浆蛋白结合率等的研究,对于了解R,S-间尼索地平的药理和毒理作用、确定药动学参数、合理用药以及质量控制具有重要意义。从而加强新药研发过程中对化合物的生理活性和生物利用度的确认,给药途径、剂型选择及相应工艺的优化,全方位提高药物质量和稳定性,为单个光学异构体的研制与开发提供试验根据。第一部分间尼索地平光学异构体的手性拆分与含量测定目的:建立间尼索地平光学异构体手性拆分及含量测定的方法。方法:采用ES-OVM柱(4.6 mm×150 mm,5μm),在30℃下,以甲醇-乙腈-0.1%的冰醋酸(15:15:70)为流动相,流速为0.8 mL·min-1,检测波长237 nm。结果:建立了间尼索地平光学异构体的手性拆分及含量测定方法。间尼索地平R,S-异构体浓度均在1.25 mg·L-1～25 mg·L-1范围内,与峰面积呈良好的线性关系,相关系数分别为r=0.9998和0.9999(n=7);最低检测限均为5 ng。结论:该方法专属性强,准确度好,灵敏度高,可用于间尼索地平光学异构体的手性拆分及含量测定,也为间尼索地平不同光学异构体进行药效学、药动学研究奠定了基础。第二部分LC-MS-MS法研究间尼索地平光学异构体的药代动力学与相对生物利用度目的:建立Beagle犬血浆中间尼索地平不同光学异构体的LC-MS-MS测定方法,研究其在Beagle犬体内的药代动力学行为,为其药代动力学研究奠定基础。方法:6只Beagle犬均口服5.0 mg·kg-1的间尼索地平,于给药后不同时间0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,8,12,24,48 h从后肢皮下隐静脉取血,置于肝素化离心塑料管中,采用乙腈沉淀蛋白后,进样50μL进行LC-MS-MS分析。血浆样品的分析测定采用ULTRON ES-OVM柱(4.6 mm×150 mm,5μm),在20℃下,以甲醇-乙腈-2 mmol·L-1醋酸铵溶液(15:15:70, v/v)为流动相,流速为0.8 mL·min-1,检测波长237 nm。扫描方式采用多重反应监测;离子化模式采用ESI选择性负离子检测。结果:首次建立了高灵敏度、高选择性的Beagle犬血浆中R,S-间尼索地平的LC-MS-MS测定方法。首次研究了R,S-间尼索地平在Beagle犬体内的药代动力学过程及相对生物利用度。方法的最低定量下限为0.25 ng·mL-1;在0.25~20 ng·mL-1的范围内呈良好的线性关系(rs=0.9958和rr=0.9983)。方法学验证的数据均在要求的范围之内,并成功应用于Beagle犬体内R,S-间尼索地平血药浓度的测定。分别测定了口服给药后血浆中R,S-间尼索地平的浓度,根据药-时曲线计算药代动力学参数,并研究其相对生物利用度。给予R,S-间尼索地平后,其Cmax分别为12.96,14.83 ng·mL-1,Tmax分别为2.5,2.7 h,t1/2分别为10.98,8.57 h,AUC0-t分别为86.07,91.56 ng·h·mL-1,AUC0-∞分别为104.09,93.21 ng·h·mL-1。统计学检验结果表明,R,S-间尼索地平Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t与AUC0-∞均无显著性差异(p>0.05),S-间尼索地平相对R-间尼索地平生物利用度为106.4%。结论:本法灵敏度高,操作方便,适合于间尼索地平不同光学异构体的药动学研究;也为间尼索地平光学异构体的临床实验研究与新药申报提供了理论依据。第三部分间尼索地平光学异构体在大鼠体内的组织分布研究目的:建立大鼠组织中R,S-间尼索地平的测定方法,并研究其组织分布规律。方法:取大鼠随机分为4组,分别灌胃给予20 mg·kg-1的R,S-间尼索地平后,于10,30,90和150 min分别放血处死,取心、肝、肺、脾、肾、脑、胃和小肠,经生理盐水冲洗,去除少量的淤血和组织内容物,并用滤纸吸去水分,称重后于匀浆器中制成0.3 g·mL-1的生理盐水匀浆,采用液-液萃取的方法。利用Symmetry C18柱(5μm, 250×4.6 mm),流动相为乙腈-水(62 : 38),流速为1.0 mL·min-1,检测波长237 nm,柱温为30℃,测定组织中的R,S-间尼索地平含量。结果:大鼠灌胃给予R,S-间尼索地平20 mg·kg-1后,两异构体在各组织中的分布无明显的不同(P>0.05)。两异构体在小肠、肺、肝和脾中,30和150 min的分布量均较90 min高,在脑组织中也有一定的分布。结论:本法灵敏度高,操作方便,适合于R,S-间尼索地平的组织分布研究;R,S-间尼索地平在大鼠体内的吸收可能存在肝肠循环现象,且能通过血脑屏障进入脑组织。第四部分间尼索地平光学异构体的大鼠在体肠吸收动力学研究目的:研究间尼索地平不同光学异构体在大鼠各肠段的吸收动力学特征,建立同时测定间尼索地平两光学异构体和酚红的含量测定方法。方法:采用大鼠在体小肠回流实验装置,利用HPLC同时测定酚红和间尼索地平光学异构体的含量。用Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm),在25℃,以乙腈-1.0%的磷酸(62:38)为流动相,流速为1.0 mL·min-1,检测波长353 nm。结果:R,S-间尼索地平在十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收速率常数分别为0.0338,0.0346,0.0370,0.0308 h-1和0.1229,0.0680,0.0567,0.0621 h-1;在小肠的吸收速率常数在不同药物浓度5,10,15μg·mL-1时分别为0.0664,0.0551,0.0402 h-1和0.0412,0.0623,0.0357 h-1;不同pH 6.5,7.4,7.9时分别为0.0543,0.0568,0.0621 h-1和0.0443,0.0513,0.0547 h-1;增溶剂吐温-80浓度0.3%,0.5%,1.0%时分别为0.0581,0.0586,0.0553 h-1和0.0483,0.0487,0.0512 h-1。结论:不同的药物浓度、pH和吐温-80的浓度对间尼索地平光学异构体在大鼠全肠段的吸收无显著影响。间尼索地平光学异构体在各肠段均有较好的吸收。该法专属性强,准确,灵敏,可用于同时对间尼索地平光学异构体和酚红进行含量测定。第五部分间尼索地平光学异构体的血浆蛋白结合率研究目的:建立间尼索地平不同光学异构体在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法,并计算不同种属血浆蛋白的相关参数。方法:采用平衡透析法测定蛋白结合率,用高效液相色谱法测定血浆中药物总浓度及游离的药物浓度。结果:R,S-间尼索地平的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:(97.4±8.2)%、(93.0±13.4)%;人血浆:(90.8±10.5)%、(89.2±9.9)%;牛血清白蛋白:(95.3±8.7)%、(91.0±5.7)%。最低定量下限为0.01 ng。结论:在体外,间尼索地平不同光学异构体与大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白结合率很高,R-间尼索地平的结合率、蛋白结合药物的表观最大能力βp、结合常数Kp及各种属蛋白结合药物的位点均较S-间尼索地平高,且均具有单一类型的结合部位。随着血浆中药物浓度升高,R-间尼索地平结合率下降,S-间尼索地平结合率升高,均具有一定的浓度依赖性。
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