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大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫

作　者: 杨冬梅
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 大肠杆菌 K88ac-STⅡ融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计特异性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分别引入NcoI和BamHI酶切位点,从大肠杆菌DE3(pET- K88ac-STⅡ)中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到K88ac-STⅡ融合基因。回收纯化后将K88ac-STⅡ融合基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击转化受体大肠杆菌Top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定证明其中含有K88ac-STⅡ融合基因片段,再测序鉴定该融合基因序列的正确性,命名为pBS-K88ac-STⅡ。之后采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门氏菌(X4550)作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因切下插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,鉴定后通过电转化引入宿主菌X4550中,再次酶切鉴定正确后,过夜培养进行SDS-PAGE和Western-Blot试验,检测其特异性蛋白表达情况。最后分别以重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)灌服小鼠作为试验组,以转化了空载体的菌株X4550(pYA3334)作为空载体对照组,同时设PBS空白对照组,分别对三个分组的小鼠进行免疫,采集血清检测其抗体效价,之后免疫小鼠用强毒株C83915(STⅡ﹢)攻击,观察结果。本实验成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门氏重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII),该重组菌株在33Kda处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致,而空载体对照菌X4550(pYA3334)在该处未有相应条带出现。Western-blot免疫印迹结果显示重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)表达的蛋白能够被K88ac阳性血清特异性结合,在相应位置出现特异性显色条带。这证明重组菌株能够表达K88ac-STII特异性融合蛋白,重组菌的体外稳定实验也证明其有良好的稳定性,从而保证了K88ac-STII抗原能够得以持续表达。而且试验小鼠灌喂重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII)后,能够产生特异性的抗体,而且对大肠杆菌强毒株具有一定的抵抗力。这为进一步研制相应的抗仔猪大肠杆菌病及相应的沙门氏菌病的双价活疫苗侯选株奠定了重要基础。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-9
英文摘要  9-10
前言  10-11
文献综述一产肠毒素大肠杆菌的研究进展  11-23
  参考文献  20-23
文献综述二减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究现状  23-34
  参考文献  31-34
实验一重组减毒沙门氏菌 X4550（pYA3334-K88ac-STII）的构建与表达  34-55
  1 材料与方法  36-46
  2 结果与分析  46-52
  3 讨论  52-54
  参考文献  54-55
实验二重组菌 X4550(pYA3334-K88ac-STII)的免疫效果研究  55-61
  1 材料与方法  55-57
  2 结果与分析  57-59
  3 讨论  59-60
  参考文献  60-61
结论  61
创新点  61-62
致谢  62-63
附件一  63-65
附件二  65-66
附件三  66-67
附件四  67-68
作者简介  68-69
导师评阅表  69

大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫

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