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汉赛巴尔通体重组外膜蛋白Pap31的研制和抗原性分析

作　者: 王君
导　师: 李冠武；温博海
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 汉赛巴尔通体外膜蛋白基因表达免疫反应性五日热巴尔通体
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

【背景目的】汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)是一类氧化酶阴性、营养条件要求苛刻的革兰氏阴性小杆菌。其所致人类疾病称为猫抓病(Cat-scratch disease, CSD),目前致病机理尚不清楚。研究发现汉赛巴尔通体的生长需要氯化高铁血红素(hemin),但其自身不能合成hemin。外膜蛋白Pap31为主要的hemin结合蛋白,通过其与hemin的结合使汉赛巴尔通体获得生长必需的铁元素。此外,研究还发现Pap31是汉赛巴尔通体表面的黏附因子,通过其黏附于宿主细胞表面而在相关的组织定植。这些均提示外膜蛋白Pap31是一重要的致病因子。本文通过对汉赛巴尔通体外膜蛋白基因pap31进行克隆表达,并初步探讨其抗原反应性,为诊断试剂和疫苗的开发提供理论依据。【实验方法】1.PCR扩增pap31基因:根据基因文库中pap31基因序列设计上下游引物,引物含有与载体相匹配的酶切位点。以汉赛巴尔通体基因组DNA为模板,采用PCR法扩增pap31基因片段,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.构建pQE30/pap31重组质粒:pap31基因片段和载体质粒pQE30经双酶切后用T4 DNA连接酶进行连接,转化感受态大肠杆菌M15,用含氨苄青霉素和卡那霉素的平板筛选阳性菌落,PCR法和双酶切法对阳性克隆进行鉴定。3.SDS-PAGE检测重组蛋白:经鉴定的重组菌用IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R250染色,脱色至本底透明后摄影成像。4.Western Blot鉴定重组蛋白的免疫反应性:将SDS-PAGE电泳分离的蛋白通过电转膜至硝酸纤维素膜,依次加入一抗、二抗进行反应,DAB显色后观察特异性结合条带。5.制备Pap31多克隆抗体:用重组蛋白Pap31按标准程序免疫小鼠,间接免疫荧光法(IFA)检测其抗体滴度。【结果】1.PCR扩增pap31基因:以汉赛巴尔通体基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出了一基因片段,其大小约为1000 bp,此扩增产物大小与预期结果相符。2.pQE30/pap31重组质粒的构建与鉴定:以PCR和双酶切方法筛选鉴定pQE30/pap31重组质粒,证实目的基因片段已成功的插入载体质粒pQE30。3.pQE30/pap31重组质粒在大肠杆菌M15中的表达: pQE30/pap31转化的大肠杆菌M15,经IPTG诱导后行SDS-PAGE电泳分析,结果显示在25 kD与35 kD Marker之间有一特有蛋白带,其分子量约为31 kD,与预期的Pap31重组蛋白大小相符。4.Western Blot结果:DAB显色发现经IPTG诱导表达的pQE30/pap31转化菌在分子量约31 kD处显现一免疫印迹带,而未诱导的pQE30/pap31转化菌、诱导的pQE30转化菌以及未诱导的pQE30转化菌均无此条带。5.间接免疫荧光法(IFA)检测Pap31免疫小鼠血清:用汉赛巴尔通体菌体抗原片对Pap31免疫小鼠血清作间接免疫荧光检测,5只免疫小鼠的血清效价均为1:5120,用此血清分别与五日热巴尔通体菌体抗原和贝氏柯克斯体菌体抗原进行反应,皆为阴性。【结论】本实验成功的构建了pQE30/pap31重组质粒, SDS-PAGE电泳证实重组质粒pQE30/pap31能够在大肠杆菌M15中成功表达外膜蛋白Pap31,间接免疫荧光法表明此重组蛋白具有良好的抗原性和汉赛巴尔通体的抗原特异性,免疫印迹法证实此重组蛋白具有良好的免疫反应性。以上结果提示重组蛋白Pap31可作为研制汉赛巴尔通体感染的新型血清学诊断试剂和预防疫苗的候选抗原分子。【背景目的】五日热巴尔通体(Bartonella quintana)是一类兼性细胞内生长、营养条件要求苛刻的革兰氏染色阴性短棒状小杆菌。可感染人类引起一系列疾病,包括五日热、慢性菌血症、心内膜炎、杆菌性血管瘤病。传播媒介为虱,人类是目前已知唯一的宿主,目前其致病机理尚不清楚,氯化高铁血红素(hemin)是许多革兰氏阴性菌获得铁元素的一种来源,研究发现已知细菌体外培养,五日热巴尔通体对hemin有最大需求量,但其自身不能合成hemin。外膜蛋白HbpA为主要的hemin结合蛋白,通过其与hemin的结合使汉赛巴尔通体获得生长必需的铁。体外研究还发现外膜蛋白HbpA抗体可以抑制五日热巴尔通体与hemin的结合能力,并呈剂量依赖性。以上均提示外膜蛋白HbpA是一重要的致病因子。本研究通过对五日热巴尔通体外膜蛋白基因hbpA进行克隆表达,并初步探讨其抗原反应性,为诊断试剂和疫苗的开发提供理论依据。【实验方法】根据基因文库中hbpA基因序列设计引物,采用PCR方法从汉赛巴尔通体基因组中扩增hbpA基因,再将扩增到的hbpA基因导入原核表达质粒pET32a(+),用该重组质粒转化大肠杆菌BL21,使hbpA基因在大肠杆菌细胞内高效表达,产生重组外膜蛋白HbpA。用该重组蛋白HbpA免疫小鼠,用间接免疫荧光法(IFA)检测其抗体滴度,Western Blot检测其抗原性。【结果】成功制备五日热巴尔通体重组外膜蛋白HbpA。研究证明该重组蛋白具有良好的抗原性,用它免疫小鼠能刺激小鼠产生高效价的特异性抗体,在免疫印迹分析中它能与HbpA免疫小鼠血清发生强烈反应。另外,在间接免疫荧光分析中,重组HbpA蛋白免疫血清能特异识别五日热巴尔通体,HbpA抗原与汉赛巴尔通体菌体抗原和贝氏柯克斯体菌体抗原无交叉性反应。【结论】本研究成功的制备五日热巴尔通体外膜重组蛋白HbpA,此重组蛋白具有良好的抗原性,其免疫血清对五日热巴尔通体的识别具有特异性,可作为研制五日热巴尔通体感染的检测试剂和预防性疫苗的候选。

汉赛巴尔通体重组外膜蛋白Pap31的研制和抗原性分析

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