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褐牙鲆干扰素调节因子3（IRF-3）和干扰素调节因子7（IRF-7）的全长cDNA克隆与表达分析

作　者: 尹湘艳
导　师: 胡国斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 遗传学
关键词: 褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) 干扰素系统干扰素调节因子3 干扰素调节因子7 基因表达分析
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖鱼类之一,近年来,随着褐牙鲆人工养殖规模的快速发展,各种疾病随之发生,尤其是病毒性病害给我国牙鲆养殖业带来了巨大的经济损失,因此对牙鲆免疫机理的研究对于控制牙鲆病害具有重要的意义。褐牙鲆属于低等脊椎动物,干扰素系统是其实现免疫防卫功能的重要分子基础。干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRFs)-3和-7属于干扰素调节因子家族成员,它们是一类多功能的转录因子,在调节干扰素和干扰素刺激基因的转录过程中发挥了重要的作用。目前,褐牙鲆IRF-3和-7尚未被克隆。本文采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)方法从褐牙鲆头肾组织中克隆出IRF-3和IRF-7的全长cDNA分子。IRF-3 cDNA有两种长度不同的变异体(GenBank登录号：GU017417,GU017418),它们是由Poly(A)加尾位点不同所致。褐牙鲆IRF-3 cDNA分子包含1404 bp开放性阅读框,编码464个氨基酸,5’非翻译区(5’UTR)长245 bp,长变异体3’非翻译区(3’UTR)长553 bp,短变异体3’UTR长327 bp。推断的IRF-3氨基酸序列中拥有DNA结合域(DBD)、IRF相关域(IAD)、丝氨酸富含域(SRD)等功能域。褐牙鲆IRF-7 cDNA(GenBank登录号：GU017419)由2032 bp组成,包括1293 bp编码区,编码430个氨基酸,5’UTR长84 bp,3’UTR长655 bp,推断的氨基酸序列也具有典型的DBD、IAD和SRD结构域。序列分析表明褐牙鲆IRF-3与IRF-7分别与其它脊椎动物的IRF-3与IRF-7有较高的同源性,进化分析将褐牙鲆IRF-3和IRF-7分别聚类于脊椎动物IRF-3和IRF-7分子簇,并同属于IRF-3亚家族。采用RT-PCR方法进行了IRF-3和IRF-7的组织分布研究。结果表明,IRF-3基因在体肾、脾和皮肤中表达水平较高,中等程度表达于食道、胃、肠、膀胱、·肌肉、头肾,而在脑、咽和性腺中表达最弱。牙鲆IRF-7基因在各个组织中都有较明显的表达,其中在脑、鳃、咽、食道、胃、肠和膀胱中呈现高水平的表达,在心脏、头肾、体肾、脾、性腺和皮肤中中等程度的表达。为了解褐牙鲆IRF-3和IRF-7基因的表达规律及其在干扰素信号系统中的地位与作用,本文利用real time PCR技术检测多聚肌胞(PolyI:C)刺激和淋巴囊肿病毒(LCDV)感染对褐牙鲆IFN-I (GenBank登录号：AB511962)、IFN-γ(GenBank登录号：AB435093)、IRF-3、IRF-7、Mx(GenBank登录号：AB110446)基因在牙鲆细胞(FG9307)和头肾中的表达影响及并分析了它们的联动表达规律。研究发现,经PolyI:C刺激或LCDV感染牙鲆细胞后,IRF-3、IRF-7、IFN-γ和Mx基因均上调表达,而IFN-I基因的表达却没有检测到。在PolyI:C刺激细胞组中,IRF-3和IRF-7的表达峰值出现在24h,均约为对照水平的3倍；IFN-y的表达峰值出现在48h,为对照水平的4倍；Mx的表达峰值出现在48h,约为对照水平的7倍。在LCDV感染细胞组中,IRF-3和IRF-7的表达峰值出现在72h,分别是对照水平的7和6倍；IFN-γ在48h后开始检测到上调表达,于96h达到峰值,为对照水平的5倍；Mx的表达峰值出现在96h,约为对照水平的7倍。LCDV感染褐牙鲆后,IFN-I、IFN-γ、IRF-7和Mx基因在头肾组织中均上调表达。IFN-I的表达量于感染后3天达到最高峰,为对照水平的48倍；IRF-7、IFN-γ和Mx基因的表达量均于感染后5天达到最高峰,分别为对照水平的14、25和80倍；IRF-3则组成型地表达于褐牙鲆的头肾组织中,其表达水平不受LCDV感染的影响。以上研究结果表明干扰素系统存在于褐牙鲆中,IRF-3和IRF-7,特别是IRF-7在褐牙鲆的抗病毒反应过程中发挥了重要的作用。本项研究为深入了解褐牙鲆的干扰素信号系统、开展相关的转基因抗病育种及开发抗病毒药物等工作奠定了基础。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-31
  1 鱼类干扰素系统的研究进展  13-20
    1.1 鱼类干扰素的发现及其作用  13-15
    1.2 鱼类干扰素分子的分类及结构  15-16
    1.3 鱼类干扰素的作用机理  16-19
    1.4 鱼类干扰素诱导蛋白  19-20
  2 鱼类干扰素调节因子家族的研究进展  20-29
    2.1 鱼类干扰素调节因子的分类及分子结构  21
    2.2 鱼类干扰素调节因子的作用  21-23
    2.3 鱼类IRF-3和IRF-7的研究进展  23-29
  3 本项研究的目的与意义  29-31
第二章褐牙鲆IRF-3和IRF-7全长cDNA克隆和序列分析  31-66
  1 实验材料  31-33
    1.1 实验动物、菌种及质粒  31
    1.2 主要设备与仪器  31-32
    1.3 主要试剂及溶液配制  32-33
  2 实验方法  33-39
    2.1 褐牙鲆组织的获取  33
    2.2 总RNA的提取及质量检测  33-34
    2.3 cDNA第一链的合成  34
    2.4 核心片段的克隆及测序  34-37
    2.5 3'RACE和5'RACE片段的克隆及测序  37-38
    2.6 全长序列的克隆及测序  38-39
    2.7 序列分析与进化树的构建  39
  3 结果分析  39-63
    3.1 RNA样品的制备与质量检测  39-40
    3.2 核心片段的克隆及测序结果  40-44
    3.3 3'RACE片段的克隆及测序结果  44-47
    3.4 5'RACE片段的克隆及测序结果  47-50
    3.5 全长序列的克隆及测序结果  50-53
    3.6 IRF-3和IRF-7基因cDNA的序列分析  53-63
  4 讨论  63-66
第三章褐牙鲆IRF-3和IRF-7基因的表达分析  66-81
  1 褐牙鲆IRF-3和IRF-7 mRNA的组织分布研究  66-68
    1.1 实验材料  66
    1.2 实验方法  66-67
      1.2.1 褐牙鲆各组织的获取  66
      1.2.2 引物设计  66-67
      1.2.3 总RNA的提取  67
      1.2.4 cDNA的合成  67
      1.2.5 RT-PCR分析  67
    1.3 结果分析  67-68
  2 PolyI:C刺激和病毒感染对IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达影响研究  68-78
    2.1 实验材料  69-70
      2.1.1 实验动物、细胞系及病毒株  69
      2.1.2 主要仪器与设备  69
      2.1.3 主要试剂及溶液配制  69-70
    2.2 实验方法  70-73
      2.2.1 PolyI:C刺激和LCDV感染牙鲆细胞  70-71
      2.2.2 LCDV感染牙鲆鱼体  71
      2.2.3 总RNA的提取  71
      2.2.4 cDNA的合成  71-72
      2.2.5 Real-time PCR  72-73
    2.3 结果分析  73-78
      2.3.1 PolyI:C刺激牙鲆细胞后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达  73-74
      2.3.2 LCDV感染牙鲆细胞后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达  74-76
      2.3.3 LCDV感染褐牙鲆后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达  76-78
  3 讨论  78-81
结论  81-82
参考文献  82-92
致谢  92-93
发表的学术论文  93

褐牙鲆干扰素调节因子3（IRF-3）和干扰素调节因子7（IRF-7）的全长cDNA克隆与表达分析

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