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发根农杆菌介导的Bt基因Cry8e转化大豆抗蛴螬研究

作　者: 刘艳菊
导　师: 周延清；韩天富
学　校: 河南师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 大豆 cry8e 载体构建发根农杆菌基因表达植物遗传转化
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大豆既是粮食作物,又是经济作物,也是工业原料,是重要的植物蛋白资源和食用油料,但是大豆害虫是影响大豆产量和质量的一个重要因素。为了防止虫害大量的使用杀虫剂,不仅对人和动物有害,也造成环境的污染。而且长期使用化学药剂也易使害虫产生抗药性,从而降低防效,造成害虫猖獗。金龟子类幼虫--蛴螬是一类世界性难防治的重要地下害虫,占地下害虫总量的80%以上。据近年来的调查,蛴螬的为害已排在各类地下害虫之首。因此,寻找抗金龟子类害虫的Bt杀虫蛋白基因并加以开发利用,生产生物工程杀虫剂和转基因植物,有效防治害虫已成为有关国民经济健康发展的大事,利用转基因技术使植物表达抗虫基因防治害虫则是综合防治害虫的重要途径之一。大量研究表明,大豆是一种较难转化的植物,而基因型是影响转化效率的最主要因素之一。本研究利用发根农杆菌介导的转基因技术,对大豆不同基因型进行转化比较,优化转化平台,以期获得转化效率较高的转化条件和基因型,为后期大豆整株转化,获得抗蛴螬转基因植株打下基础。同时利用获得阳性根进行分子检测和生物活性检测,均获得较好结果。其主要工作结果如下:1.构建含Cry8e基因的植物表达载体pCAMBIA1305.1-35S-8e,利用农杆菌介导转化大豆,获得转基因发状根。2.利用构建好的载体转化十个不同基因型大豆,均获得发状根,但转化效率差异显著,吉林小粒转化效率最高。3.从十个基因型中选取四个差异不显著的基因型,分别进行光培养和暗培养,经比较分析发现两种共培养方式,转化效率均差异不显著。4.从十个基因型中选取两个基因型,分别选择23℃、25℃、28℃进行共培养,结果发现,三个温度条件下转化效率差异不显著。5.从十个基因型中选择两个,分别在潮霉素浓度为10mg/L、12mg/L、14mg/L、16mg/L、18mg/L的梯度下进行筛选,比较转化效率。6.选择三个转化效率较高的基因型,利用上述转化条件,在无菌条件下获得大量转基因根系,进行大量扩繁。利用扩繁材料进行PCR、Western检测,均有目的带出现,说明该基因转化成功,并能在大豆根系中正确表达,从而验证了该基因在大豆中表达特性。7.取上述阳性扩繁根,饲喂金龟子幼虫-蛴螬,进行生物活性测定,杀虫活性最高达80%以上,表现出良好的杀虫效果,说明该基因转入大豆后,抗性功能良好。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
1 前言  11-21
  1.1 大豆概述  11
  1.2 大豆主要病虫害  11-12
  1.3 大豆转基因研究现状  12-13
  1.4 大豆转基因主要方法  13-15
    1.4.1 农杆菌介导转化法  13
    1.4.2 基因枪法  13-14
    1.4.3 花粉管通道法  14
    1.4.4 显微注射法(microinjection)  14-15
    1.4.5 电击法  15
  1.5 抗虫转基因研究进展  15-17
    1.5.1 国外Bt 转基因工程研究进展  15-16
    1.5.2 国内Bt 转基因工程研究进展  16-17
    1.5.3 其他抗虫转基因研究进展  17
  1.6 发根农杆菌研究进展  17-19
    1.6.1 发根农杆菌的生物学特性  17-18
    1.6.2 发根农杆菌转化方法  18
    1.6.3 发根农杆菌的应用  18-19
  1.7 研究目的和意义  19-21
2 材料与方法  21-35
  2.1 试验材料  21-23
    2.1.1 菌株和质粒  21
    2.1.2 植物材料  21
    2.1.3 主要仪器设备  21-22
    2.1.4 酶及试剂  22
    2.1.5 培养基  22
    2.1.6 实验引物  22-23
  2.2 实验方法  23-27
    2.2.1 农杆菌的培养和菌种的保存  23
    2.2.2 发根农杆菌感受态细胞制备  23
    2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化  23-24
    2.2.4 农杆菌质粒DNA 的提取  24
    2.2.5 大肠杆菌质粒DNA 的提取  24
    2.2.6 DNA 回收Kit 法（百泰克多功能DNA 纯化回收试剂盒）  24-25
    2.2.7 pCAMBIA1305.1-355-8e 载体构建与鉴定  25-27
  2.3 发根农杆菌介导的子叶节转化体系的优化  27-28
    2.3.1 十个不同基因型大豆转化效率统计分析  27-28
  2.4 转化根系的检测方法  28-34
    2.4.1 GUS 活性检测  28-29
    2.4.2 基因组DNA PCR 检测  29-30
    2.4.3 基因组蛋白检测分析  30-32
    2.4.4 Western blot 分析  32-34
  2.5 转化率的统计方法  34
  2.6 数据分析  34
  2.7 阳性根的扩繁  34
    2.7.1 阳性根的选择  34
    2.7.2 固体扩繁  34
    2.7.3 液体扩繁  34
  2.8 生物活性检测  34-35
3 结果与分析  35-45
  3.1 载体验证结果  35-36
    3.1.1 含Cry8e 基因的菌落PCR 结果  35
    3.1.2 双酶切验证结果  35-36
    3.1.3 pCAMBIA1305. 1-355-8e 质粒交叉双酶切验证结果  36
    3.1.4 pCAMBIA1305. 1-355-8e 质粒T-DNA 结构图谱  36
  3.2 不同基因型不同转化条件转化效率统计分析结果  36-39
    3.2.1 不同基因型大豆产生发状根时间  36-37
    3.2.2 不同基因型大豆转化效率统计结果  37-38
    3.2.3 不同共培养方式对转化效率的影响  38-39
    3.2.4 不同潮霉素浓度对转化效率的影响  39
  3.3 阳性根的获得与扩繁  39-40
  3.4 转化根系的分子检测  40-42
    3.4.1 GUS 基因表达检测  40-41
    3.4.2 转基因发状根的PCR 检测  41
    3.4.3 转基因发状根的Western blot 检测  41-42
  3.5 生物活性测定  42-45
4 小结与讨论  45-47
  4.1 发根农杆菌转化体系的优化  45
  4.2 Cry8e 基因的验证分析  45-47
5 展望  47-49
参考文献  49-55
致谢  55-56
攻读学位期间发表的学术论文目录  56-57

发根农杆菌介导的Bt基因Cry8e转化大豆抗蛴螬研究

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