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酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建及其生物学性质研究

作　者: 陈永金
导　师: 黄建忠
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母 HOR2基因基因敲除乙醇甘油
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 25次
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内容摘要

工业革命以来,世界经济的发展离不开能源的发展,化石燃料一直是能源供应的主流、经济发展的支撑点。但是,随着科学技术的发展、工业的进步以及人口的膨胀,对能源的需求越来越紧迫。但是由于这些化石燃料属于不可再生燃料,在不同程度上都会对环境造成污染和破坏,因而找到一种可再生的燃料将是关键。生物作为可再生能源开发的媒介尤为重要,其中以可再生的燃料乙醇凸显。作为传统真核模式生物菌的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是典型的乙醇产生菌,现已被广泛的用于生物乙醇的实验研究和发酵生产。甘油是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乙醇代谢的主要副产物之一。酿酒酵母中含有两个基因(HOR2, RHR2)编码与甘油代谢相关的3-磷酸甘油酯酶系。其中,HOR2为渗透压调节型,在高渗透压的条件下有较大量的表达；而RHR2则为厌氧调节型,在缺氧的条件下有较多量的表达。因此,通过敲除HOR2或者RHR2(本研究选择敲除HOR2)基因在一定条件下可以阻断或者部分的阻断甘油代谢,从而减少甘油的产生,最终使更多的碳源用于转化生成乙醇,为酿酒酵母代谢调控打下一定的基础。本论文通过设计含有与HOR2 (GPP2)基因两侧序列同源的长引物,以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) YS2,获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒pSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。从而成功的获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株,并命名为YS2-HOR2。发酵实验表明,突变株甘油产量降低3.34%,乙醇产量提高1.96%。

全文目录

中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-8
目录  8-11
绪论  11-25
  1 研究背景  11-14
    1.1 生物质能概念及其分类  11-13
    1.2 燃料乙醇的优点及其发展方向  13-14
    1.3 酿酒酵母是传统的乙醇代谢菌株  14
  2 酿酒酵母育种方法的发展情况  14-17
    2.1 常规育种  15-16
    2.2 原生质体融合育种  16
    2.3 分子育种  16-17
  3 基因敲除技术  17-21
    3.1 基因插入突变  18
    3.2 RNA干扰  18-19
    3.3 基因同源重组  19-21
    3.4 基因敲除技术展望  21
  4 3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶对甘油代谢的影响  21-23
    4.1 3-磷酸甘油脱氢酶  21-22
    4.2 3-磷酸甘油酯酶  22-23
  5 本研究目的意义  23-25
第一章材料与方法  25-41
  第一节实验材料  25-31
    1.1.1 菌种与质粒  25
    1.1.2 培养基  25-26
    1.1.3 寡聚核苷酸引物  26-27
    1.1.4 酶和试剂  27
    1.1.5 主要仪器  27-28
    1.1.6 试剂与溶液的配制  28-31
  第二节实验方法  31-41
    1.2.1 Cre/LoxP系统  31
    1.2.2 酵母YS2基因组DNA的提取  31-32
    1.2.3 聚合酶链式反应(PCR)  32
    1.2.4 通过菌落PCR来验证酵母菌落  32-33
    1.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  33
    1.2.6 质粒pUG6与pSH65的转化  33-34
    1.2.7 碱裂解法制取pUG6及pSH65质粒DNA  34-35
    1.2.8 UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA  35-36
    1.2.9 乙醇沉淀DNA  36
    1.2.10 平板影印法  36
    1.2.11 LiAc/SS载体DNA/PEG化学高效转化法  36-38
    1.2.12 突变株生理特性的实验  38
    1.2.13 突变株乙醇代谢的发酵测定实验  38-39
    1.2.14 突变株发酵甘油的测定  39-41
第二章结果与讨论  41-57
  第一节实验结果  41-55
    2.1.1 酵母出发菌(YS2)基因组DNA的提取  41
    2.1.2 酵母YS2的HOR2基因的存在性验证  41-42
    2.1.3 质粒pUG6、pSH65的扩增及鉴定  42-45
      2.1.3.1 质粒pUG6、pSH65的扩增  42-43
      2.1.3.2 质粒pUG6的酶切验证  43-44
      2.1.3.3 质粒pSH65的酶切验证  44-45
    2.1.4 构建HOR2基因敲除组件  45-47
      2.1.4.1 HOR2基因敲除组件的构建  45-46
      2.1.4.2 基因敲除组件的测序验证  46-47
    2.1.5 HOR2基因的敲除  47-51
      2.1.5.1 HOR2基因敲除组件的转化及其克隆子筛选  47-48
      2.1.5.2 克隆子验证  48-49
      2.1.5.3 kan~T筛选标记的切除  49-51
      2.1.5.4 HOR2等位基因的敲除  51
    2.1.6 YS2-HOR2突变株生理特性试验  51-52
      2.1.6.1 突变株生长状况  51-52
      2.1.6.2 突变株的稳定性实验  52
    2.1.7 突变株发酵液甘油和乙醇产量的测定  52-55
      2.1.7.1 突变株YS2-HOR2发酵液甘油产量测定  52-53
      2.1.7.2 突变株YS2-HOR2发酵液乙醇含量的测定  53-55
  第二节讨论  55-57
第三章结论  57-59
附录1 波美度、糖度、比重换算表  59-61
附录2 主要符号对照表  61-63
参考文献  63-70
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  70-71
致谢  71-72
个人简历  72

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