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食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养和增殖的初步研究

作　者: 许丹娜
导　师: 卢晟盛
学　校: 广西大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 食蟹猴 成纤维细胞 体外培养 生长特性 MTT比色法 增殖
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 54次
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内容摘要


本论文选取了非人灵长类动物——食蟹猴为研究对象,采用组织块贴壁培养法,构建了食蟹猴耳部组织成纤维细胞的体外培养体系,并对其生长特性进行了研究。在建立培养体系的基础上,运用MTT比色法分析了不同浓度表皮生长因子(EGF)、胰岛素(Insulin)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对5%和10%两种血清浓度下培养细胞增殖能力的影响。研究结果如下:1、采用组织块培养法可以获得食蟹猴耳部原代培养物。2、用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代。3～5次传代后,培养细胞逐渐纯化,为典型的成纤维型细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形。细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走势。3、用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液,采取手工冷冻法对细胞进行冷冻保存,冻存浓度为5×10~6个/ml。通过台盼蓝染色法对不同代数细胞冻存前后活率进行测定,结果发现虽然复苏后存活率有所下降,但均保持在90%以上,传代后细胞形态和生长速度没有明显变化。4、绘制的细胞生长曲线呈“S”型,细胞生长经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合体外细胞生长规律。5、对第10、15、20和25代细胞的染色体倍性进行分析,发现二倍体染色体数为2n=42。虽然随着传代次数的增加,二倍体细胞所占比例有所下降,但仍在80%以上,且四代之间无显著差异(P＞0.05)。6、当培养液中血清浓度为5%时,分别添加20～80 ng/ml的EGF、1、5μg/ml的胰岛素、50～100 ng/ml浓度的IGF-I可显著促进细胞增殖(P＜0.05)。7、当培养液中血清浓度为10%时,分别添加10～40 ng/ml的EGF、10、15μg/ml的胰岛素、25～100 ng/ml浓度范围内的IGF-I可显著促进细胞增殖(P＜0.05)。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一部分 文献综述  12-25
  前言  13
  1 动物细胞体外培养简史  13-14
  2 动物细胞体外培养的主要环节  14-19
    2.1 原代细胞的获得及培养  14-17
      2.1.1 酶消化法  15-16
      2.1.2 组织块培养法  16-17
    2.2 传代培养  17
    2.3 细胞的冻存和复苏  17-19
  3 细胞在体外的生长过程  19-21
    3.1 细胞体外培养的整个生长过程  19-20
    3.2 细胞在体外培养一代内的生长过程  20-21
  4 影响动物细胞体外生长的因素  21-24
    4.1 培养基对细胞生长的影响  21-22
      4.1.1 合成培养基  21
      4.1.2 天然培养基  21-22
      4.1.3 促细胞生长物质  22
    4.2 物理化学因素的影响  22-23
      4.2.1 pH及气相  22-23
      4.2.2 温度  23
      4.2.3 渗透压  23
    4.3 微生物污染  23
    4.4 其他因素  23-24
  5 本试验研究的目的和意义  24-25
第二部分 试验研究  25-50
  第一章 食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养体系的初步建立  26-41
    第一节 前言  26
    第二节 材料和方法  26-30
      2.1 材料  26-28
        2.1.1 试验材料  26
        2.1.2 主要试剂及药品  26-27
        2.1.3 主要仪器设备及耗材  27
        2.1.4 主要溶液配制  27-28
      2.2 试验方法  28-30
        2.2.1 食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞的分离和体外培养  28-29
        2.2.2 细胞活力检测  29
        2.2.3 细胞生长曲线的绘制  29
        2.2.4 细胞染色体制备  29-30
      2.3 数据统计方法  30
    第三节 结果与分析  30-34
      3.1 食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养的形态学观察  30-31
        3.1.1 原代细胞的生长情况  30-31
        3.1.2 细胞的传代培养  31
      3.2 细胞的冻存与复苏  31-32
      3.3 细胞生长曲线绘制  32
      3.4 细胞染色体倍性分析  32-34
    第四节 讨论  34-39
      4.1 食蟹猴耳部成纤维细胞的分离和原代培养  34-35
      4.2 成纤维细胞的传代培养  35-36
      4.3 细胞生长曲线的绘制  36-37
      4.4 细胞的冻存与复苏  37-38
      4.5 染色体倍性分析  38-39
    第五节 小结  39-41
  第二章 EGF、Insulin和IGF-I对体外培养的食蟹猴耳部成纤维细胞增殖的影响  41-50
    第一节 前言  41
    第二节 材料和方法  41-42
      2.1 试验材料  41-42
        2.1.1 试验动物  41
        2.1.2 主要试剂及药品  41
        2.1.3 主要仪器  41-42
        2.1.4 主要溶液配制  42
      2.2 试验方法  42
        2.2.1 耳部成纤维细胞的培养  42
        2.2.2 用MTT比色法检测添加不同物质对食蟹猴耳部成纤维细胞增殖的影响  42
        2.2.3 试验设计  42
      2.3 数据统计方法  42
    第三节 结果与分析  42-46
      3.1 不同浓度EGF对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响  43-44
      3.2 不同浓度胰岛素对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响  44-45
      3.3 不同浓度IGF-I对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响  45-46
    第四节 讨论  46-48
      4.1 MTT比色法在检测细胞增殖的应用及其影响因素  46
      4.2 EGF对细胞增殖的影响  46-47
      4.3 胰岛素对细胞增殖的影响  47-48
      4.4 IGF-I对细胞增殖的影响  48
    第五节 小结  48-50
第三部分 总结和结论  50-52
  1、总结  50-51
  2、结论  51-52
参考文献  52-61
附录  61-62
附图  62-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表论文情况  66

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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