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蚕丝蛋白/明胶复合肝组织工程材料生物相容性研究

作　者: 杨照
导　师: 周新民
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: MTT比色法蚕丝蛋白明胶肝组织工程细胞相容性组织相容性
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【背景】理想的肝组织工程可作为有效的生物人工肝替代支持系统,为急性肝功能衰竭及终末期肝病患者提供有效的替代治疗,为患者自身肝脏的再生及等待肝源争取宝贵时间。近年来肝组织工程在组织工程发展的大背景下获得了巨大的成效,载体材料和种子细胞是肝组织工程的两大基础,而这两者的相容性是构建理想肝组织工程的关键环节。蚕丝蛋白是一种生物相容性较好的材料,其具有较高强度和韧性,被广泛应用于骨组织工程和皮肤组织工程。明胶源自天然胶原蛋白,胶原是软骨组织中的主要结构蛋白,使软骨组织具有其独特的力学性质。而且胶原蛋白也有利于细胞的黏附、增殖和分化,可降解并为新生组织提供足够的空间。近年来,研究者尝试将蚕丝蛋白与胶原复合支架应用于肝组织工程,借以充分发挥二者的特性。本文研究不同配比蚕丝蛋白/明胶复合材料与体外建系的肝脏细胞相容性,及其在大鼠体内的组织相容性和降解情况,为肝组织工程选择更好的载体材料奠定基础。【目的】研究蚕丝蛋白/明胶三维材料支架对人永生化肝细胞系QZG细胞贴附、增殖及凋亡的影响和蚕丝蛋白/明胶三维材料支架在SD大鼠体内所引起的免疫排斥反应以及随着时间的降解情况。【方法】(1)采用四氮唑盐比色法(MTT)检测QZG细胞在四种比例蚕丝蛋白/明胶复合膜材料上的增殖情况。(2)细胞计数法检测QZG细胞在四种比例蚕丝蛋白/明胶复合膜材料上的增殖情况。(3)流式细胞仪检测QZG细胞在四种比例蚕丝蛋白/明胶复合膜材料上的凋亡情况。(4)用扫描电镜观察QZG细胞在四种比例蚕丝蛋白/明胶三维生物材料上的贴附与增殖情况。(5)将四种不同比例总共180个蚕丝蛋白/明胶三维材料支架分别植入三个时间组共60只雄性SD大鼠(200-250g)背部皮下,每个时间组内每种比例材料支架植入5只大鼠背部皮下,每只大鼠均匀植入三个同种比例材料,分别于植入后第7天、第14天、第30天处死组内各个比例蚕丝蛋白/明胶三维材料支架所植入的5只大鼠,取出被皮下纤维包裹的材料,甲醛固定后送HE切片染色,观察炎性渗出及材料降解情况。【结果】(1) QZG细胞在蚕丝蛋白生物材料上具有增殖活性,MTT及细胞计数实验显示随着明胶成份在复合材料中所占比例增加,复合材料上细胞增殖活性明显增强并有统计学意义,其中增殖较为明显的材料比例为蚕丝蛋白(wt%):明胶(wt%)=4:4。(2)流式细胞检测显示,第一天除纯蚕丝蛋白以外其他各种比例蚕丝蛋白/明胶复合膜材料与对照组上QZG细胞凋亡率无明显差异,细胞活性相同;第五天各种比例蚕丝蛋白/明胶复合膜材料上QZG细胞凋亡率有明显差异,QZG细胞凋亡率随明胶比例增加而减少,其中凋亡较少的材料比例为蚕丝蛋白(wt%):明胶(wt%)=4:4。(3)扫面电镜结果显示纯蚕丝蛋白材料上QZG细胞粘附状态一般,增殖不明显;其余各组QZG细胞在材料支架微孔中贴附紧密,培养第三天细胞增殖不明显,少量分泌细胞外基质;第七天细胞增殖明显,细胞外基质分泌增加,蚕丝蛋白(wt%):明胶(wt%)=4:4比例复合三维材料支架细胞第七天大量分泌细胞外基质,细胞增殖明显,贴附状态最佳。(4)各种比例材料第7天HE切片染色均显示较少单核细胞及中性粒细胞等炎性细胞渗出;第14天HE切片染色显示单核细胞及中性粒细胞等炎性细胞伴少量成纤维细胞渗出,材料开始出现降解,第30天各组材料大部分被组织机化、降解,大量成纤维细胞包绕材料残片;三种比例中,30天降解最慢的材料为纯蚕丝蛋白,降解最快的材料为蚕丝蛋白(wt%):明胶(wt%)=4:4。【结论】蚕丝蛋白与明胶复合材料支架具有良好的细胞贴附性能以及良好的组织相容性和一定的降解能力,蚕丝蛋白/明胶配比中,4:4比例在体外细胞增殖与凋亡、体内免疫排斥实验中体现出优势,通过改进在肝组织工程应用方面将具有一定应用前景。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-25
  1 生物材料生物相容性的概念  17
  2 体外细胞毒性试验的概念及类型  17-23
  3 动物体内植入试验  23
  4 蚕丝蛋白和明胶生物材料  23-25
第一部分蚕丝蛋白/明胶复合生物材料支架体外细胞毒性试验  25-36
  1 材料和仪器  25-26
    1.1 细胞株和生物材料支架  25
    1.2 主要试剂  25-26
    1.3 主要仪器  26
  2 方法  26-28
  3 结果  28-35
  4 讨论  35-36
第二部分蚕丝蛋白/明胶复合生物材料支架体内植入试验  36-44
  1 材料  36-37
    1.1 动物和生物材料支架  36
    1.2 主要试剂  36
    1.3 主要仪器  36-37
  2 方法  37-38
  3 结果  38-43
  4 讨论  43-44
小结  44-45
参考文献  45-52
个人简历和研究成果  52-54
致谢  54-55

蚕丝蛋白/明胶复合肝组织工程材料生物相容性研究

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