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酿酒酵母skp1和rav2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

作　者: 张光明
导　师: 张震宇
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母液泡ATP酶 RAVE Skp1p Rav2p 克隆表达纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

V-ATP酶（vacuolar ATPase）又称液泡ATP酶,是一种广泛存在于真核生物细胞膜结构中靠水解ATP产生的能量来转移质子从而调节细胞内外pH值的一种ATP酶。V-ATP酶在环境中的葡萄糖浓度降低时可以可逆分解为V0和V1两部分来调节酶的活性。RAVE （regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes）复合物在V-ATP酶此种活性调节方式中起到重要作用。RAVE复合物由Skplp、Ravlp和Rav2p三个亚基组成。目前有关RAVE结构和性质以及RAVE对V-ATP酶活性调节机理的研究很少。根据NCBI报道的来源于酿酒酵母的skp1基因序列和表达载体pET-21c设计引物,然后以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板扩增skp1。将纯化后的PCR产物直接用Nde I和Not I双酶切,然后与经同样双酶切的表达载体pET-21c连接构建重组质粒pET-21cS1。经PCR和双酶切验证后的质粒再经DNA测序进一步验证,克隆的基因完全正确。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中经1 mmol/L的IPTG,25℃诱导4 h,表达出Skplp。诱导后的大肠杆菌经超声细胞破碎,再经Ni-NTA凝胶纯化得到可溶的目的蛋白。以酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板扩增rav2。将纯化后的rav2与pUCm-T载体相连构建重组质粒命名为pUCTR2。将质粒pUCTR2用Nde I和Not I双酶切,然后胶回收rav2,并将其与经过同样酶切的表达载体pET-21 c相连构建重组质粒pET-21cR2。经PCR和双酶切验证后的质粒再经DNA测序进一步验证,克隆的基因完全正确。将重组质粒pET-21cR2转入大肠杆菌BL21（DE3）。重组菌在1 mmol/L IPTG,25℃,150r/min的诱导条件下表达出目的蛋白Rav2p,但大部分为包涵体。经过表达条件的优化,发现在LB培养基中添加0.5%的葡萄糖并在0.5 mmol/L的IPTG,16℃,80r/min条件下诱导10 h可得到更多可溶的Rav2p。诱导后的大肠杆菌经超声破碎,再经Ni-NTA凝胶纯化得到可溶的样品。根据SOPMA的预测,酿酒酵母的Rav2p中含有46.72%的α螺旋,17.66%的p折叠,4.84%的β转角和30.77%的无规则卷曲。在NCBI中BLAST的结果显示：酿酒酵母的Rav2p与Zygosaccharomyces rouxii中的ZYRO0C04554p同源性为49%；与Vanderwaltozyma polyspora中的Kpol₁064p58同源性为49%；与Ashbya gossypii中的AGL104Cp的同源性为45%。酿酒酵母Rav2p氨基酸序列的保守区分析显示,Rav2p属于Rogdi-lz家族中功能未知的一种蛋白。Rav2p中含有20个含硫氨基酸和13个脯氨酸,这种氨基酸组成可能是造成其在大肠杆菌中易形成包涵体的重要原因。以构建好的重组质粒pET-21cR2为模板扩增rav2。将纯化后的rav2与共表达载体pETDuet-1经BamH I和Sal I双酶切后连接构建重组质粒pETDuet-R2。经PCR与双酶切验证,选择正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经1 mmol/L的IPTG,25℃诱导2h后表达Rav2p。以构建好的pET-21cS1为模板扩增skp1。将纯化后的skp1直接用Nde I和Xho I双酶切,然后与经同样双酶切的重组质粒pETDuet-R2相连构建共表达质粒pETDuet-R2Sl.将共表达质粒pETDuet-R2Sl经PCR与双酶切验证后再经DNA测序进一步验证,证明skp1与rav2均克隆正确。含共表达质粒的BL21（DE3）在终浓度为1 mmol/L的IPTG,25℃,150 r/min的诱导条件下诱导6 h,SDS-PAGE显示没有出现目的蛋白条带。诱导条件改为1 mmol/L的IPTG,37℃,150 r/min后,诱导2h时,表达出Skplp但是没有表达出Rav2p,诱导4h时,表达出Skp1p和Rav2p。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-16
  1.1 研究背景  9-11
    1.1.1 V-ATP酶的结构  9
    1.1.2 V-ATP酶的功能  9-10
    1.1.3 V-ATP酶的活性调节方式  10-11
    1.1.4 V-ATP酶的研究展望  11
  1.2 RAVE的研究进展  11-14
    1.2.1 RAVE的发现与命名  11-12
    1.2.2 RAVE的结构  12-13
    1.2.3 RAVE的功能  13-14
  1.3 外源基因在大肠杆菌中的表达  14-15
    1.3.1 pET表达系统原理与特点  14
    1.3.2 影响外源基因在大肠杆菌中表达的主要因素  14-15
  1.4 研究思路与内容  15-16
第二章材料与方法  16-25
  2.1 材料  16-18
    2.1.1 菌种与质粒  16
    2.1.2 工具酶及主要试剂  16
    2.1.3 培养基  16
    2.1.4 主要溶液配制  16-18
    2.1.5 主要仪器设备  18
  2.2 方法  18-25
    2.2.1 酿酒酵母基因组的提取  18
    2.2.2 引物设计  18-19
    2.2.3 skp1和rav2的PCR扩增  19-20
    2.2.4 大肠杆菌JM109和BL21(DE3)高效感受态细胞的制备及转化  20-21
    2.2.5 重组质粒的构建与验证  21-22
    2.2.6 目的蛋白的诱导表达  22-23
    2.2.7 目的蛋白的纯化  23-24
    2.2.8 Rav2p的生物信息学分析  24
    2.2.9 其它方法  24-25
第三章结果与讨论  25-42
  3.1 酿酒酵母中Skp1p基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与纯化  25-28
    3.1.1 skp1的克隆  25
    3.1.2 重组质粒pET-21cS1的构建  25-26
    3.1.3 Skp1p的表达  26-28
    3.1.4 Skp1p的纯化  28
  3.2 酿酒酵母中Rav2p基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与纯化  28-36
    3.2.1 rav2的克隆  28-29
    3.2.2 重组质粒pUCTR2的构建与鉴定  29-30
    3.2.3 重组质粒pET-21cR2的构建与鉴定  30-31
    3.2.4 Rav2p的表达  31
    3.2.5 Rav2p表达条件的优化  31-33
    3.2.6 Rav2p的纯化  33
    3.2.7 Rav2p的生物信息学研究  33-36
  3.3 酿酒酵母中Skp1p和Rav2p在大肠杆菌中的共表达  36-42
    3.3.1 重组质粒pETDuet-R2S1构建过程示意图  36-37
    3.3.2 rav2基因的克隆  37
    3.3.3 重组质粒pETDuet-R2的构建与鉴定  37
    3.3.4 Rav2p的表达  37-38
    3.3.5 skp1基因的克隆  38
    3.3.6 重组质粒pETDuet-R2S1的构建与鉴定  38-39
    3.3.7 Rav2p与Skp1p在大肠杆菌中的共表达  39-42
主要结论和展望  42-44
致谢  44-45
参考文献  45-49
附录1:测序图谱  49-52
附录2:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  52

酿酒酵母skp1和rav2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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