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湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建及木聚糖酶基因的筛选、分析

作　者: 安培培
导　师: 叶均安；刘建新
学　校: 浙江大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: Fosmid 文库木聚糖酶基因瘤胃微生物编码序列序列相似性 TCA 结构域编码产物 TTG CAA 丝状 GCA 生物合成 AAC 阳性克隆硕士学位论文 ATC 同源性 TTT
分类号: S852.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 213次
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内容摘要

湖羊瘤胃中存在大量不能进行纯培养的微生物,构建宏基因组文库是开发未培养微生物的有效途径。为了对瘤胃中产木聚糖酶微生物进行研究,通过构建瘤胃微生物的Fosmid文库,在对其库容量、稳定性和功能进行分析的基础上,筛选具有木聚糖酶活性的阳性克隆。文库共获得克隆12704个,插入片断平均为30.9 kb(17-55 kb),所建文库容量为393 Mb。在连续传代100次时,文库仍保持很好的稳定性。通过刚果红染色分析获得18个具有木聚糖酶活性的阳性克隆。从中选取一个(克隆HF94)进行序列测定,序列分析结果表明,HF94中有39个编码序列(CDSs),其中19个(48.7%)和其它有机体表现出明显的相似性,15个保守假定蛋白的编码序列(38.5%)以及5个(12.8%)在任何数据库中都没找到有相似序列的假定蛋白的编码序列(图3.2和表3.2)。这19个功能编码的蛋白的编码序列参与环境信息处理、遗传信息处理、翻译、氨酰基-tRNA生物合成、复制和修理；DNA转录、复制、核苷酸的运输和新陈代谢、氨基酸和碳水化合物的新陈代谢,脂质代谢和脂肪酸生物合成、辅酶的新陈代谢降解和生物合成以及次生代谢物生物降解,能源的产生和转换、辅因子和维生素的代谢、泛酸和CoA生物合成、检验和细胞膜生物转起源,其中有三个编码序列参与碳水化合物代谢(CDS6,CDS7,CDS30)。CDS6的ORF由942个核苷酸组成,可编码一个含313个氨基酸的蛋白质,该蛋白含有一个糖基水解酶家族11结构域(pfam00457)。CDS6的编码产物与Neocallimastix frontalis的内切木聚糖酶同源性最高,氨基酸序列相似性为79%,与产琥珀酸丝状杆菌S85的内切-1,4,-β-木聚糖酶氨基酸序列相似性为60%。CDS7的ORF由1166个核苷酸组成,可编码一个含387个氨基酸的蛋白质,该蛋白含有一个糖基水解酶家族16结构域(pfam00722)。CDS7的编码产物与产琥珀酸丝状杆菌S85的地衣淀粉酶同源性最高,氨基酸序列相似性为84%。CDS30的ORF由2973个核苷酸组成,可编码一个含990个氨基酸的蛋白质,该蛋白含有一个糖基水解酶家族79结构域(pfam03662)。CDS30的编码产物与产琥珀酸丝状杆菌S85的凝血因子5／8型域蛋白同源性最高,氨基酸序列相似性为91%,与黄灰链霉菌ATCC33331的纤维素结合家族Ⅱ氨基酸序列相似性为44%。HF94中CDS5编码的蛋白与产琥珀酸丝状杆菌S85中ybaK/ebsC蛋白同源性最高,氨基酸序列相似性为98%；CDS12编码的蛋白与产琥珀酸丝状杆菌S85中threonyl-tRNA synthetase同源性最高,氨基酸序列相似性为98%,ybaK/ebsC蛋白和threonyl-tRNA synthetase是微生物的持家基因,因此HF94可能来自产琥珀酸丝状杆菌。对克隆HF94进行酶活测定,发现在此克隆中存在的木聚糖酶HFXY94的最适pH值在4.5左右,温度在60℃左右。此最适条件下酶活为46.14 u/mL。

全文目录

目录  6-9
图表一览表  9-10
摘要  10-12
Abstract  12-14
第一章文献综述  14-27
  1 木聚糖以及木聚糖酶  14-18
    1.1 木聚糖  14-16
    1.2 木聚糖酶  16-18
  2 瘤胃微生物  18-21
    2.1 瘤胃微生物种类  18-20
    2.2 产木聚糖酶的微生物  20-21
  3 宏基因组学简介  21-25
    3.1 宏基因组学的概念  21-22
    3.2 宏基因组文库的分类  22-23
    3.3 宏基因组文库的构建及筛选  23-24
    3.4 瘤胃宏基因组学的应用  24-25
  4 本研究的目的和意义  25-27
第二章湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建  27-40
  1 材料  27-30
    1.1 瘤胃样品来源  27
    1.2 主要试剂和仪器  27-28
    1.3 Fosmid载体及大肠杆菌菌种的保存  28-29
    1.4 培养基和抗生素的配制  29
    1.5 常规溶液,缓冲液的配制  29-30
  2 方法  30-36
    2.1 瘤胃微生物DNA的提取  30-31
    2.2 瘤胃微生物DNA的纯化  31
    2.3 "插入DNA"的末端修复  31-32
    2.4 连接反应  32-33
    2.5 CopyControl Fosmid克隆的包装  33-34
    2.6 CopyControl Fosmid文库的涂布与筛选  34
    2.7 CopyControl Fosmid文库的保存  34
    2.8 Fosmid文库稳定性及库效率的评定  34-36
  3 结果  36-38
    3.1 总DNA的提取和纯化  36-37
    3.2 文库的稳定性及库效率的评价  37-38
  4 讨论  38-39
  5 本章小结  39-40
第三章文库中木聚糖酶基因的筛选与分析  40-59
  1 材料与方法  40-45
    1.1 样品来源  40
    1.2 主要试剂  40-41
    1.3 木聚糖酶的筛选方法  41
    1.4 Fosmid阳性克隆质粒的提取和纯化  41-43
    1.5 木聚糖酶基因的序列分析  43
    1.6 木聚糖酶活性的测定  43-45
  2 结果与分析  45-57
    2.1 文库的木聚糖酶活力分析  45-46
    2.2 木聚糖酶基因序列分析结果  46-56
    2.3 克隆HF94酶学活性的初步研究  56-57
  3 讨论  57-58
  4 本章小结  58-59
第四章小结、创新点及研究展望  59-60
  1 小结  59
  2 创新点  59
  3 研究展望  59-60
参考文献  60-66
攻读学位期间发表的学术论文目录  66-67
致谢  67-68
附件  68-105

湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建及木聚糖酶基因的筛选、分析

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