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RNAi沉默整合素链接激酶基因对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响及其作用机制的研究

作　者: 刘宁
导　师: 宋少伟
学　校: 中国医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰腺癌 ILK siRNA RNAi Panc-1细胞 RT-PCR Western blot 基因治疗
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 51次
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内容摘要

目的构建整合素链接激酶(ILK)基因RNA干扰(RNA interference, RNAi)表达载体,研究其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的抑制作用及其对胰腺癌细胞增殖的影响。为研究胰腺癌的发病机制与治疗提供理论依据。方法设计三对针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,并根据该序列合成两条小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制性酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。经PCR和测序的方法鉴定重组质粒是否构建成功。通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒和阴性对照质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418筛选4周后以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,用荧光显微镜观察质粒表达效率。挑选阳性单克隆继续在G418压力下扩大培养4周后,再以GFP基因为报告基因,用流式细胞仪和荧光显微镜观察质粒表达效率。应用半定量RT-PCR方法,检测胰腺癌PANC-1细胞中ILK mRNA表达水平,应用Western-Blot方法,检测胰腺癌PANC-1细胞中ILK基因蛋白表达水平。筛选出干扰效率最高的重组质粒。MTT实验：每组约2,000细胞接种96孔细胞培养板上,在37℃、5%CO2的培养箱中培养。分别与Oh、24h、48h、72h和96h取出细胞,每孔加l0μLMTT染液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h后离心,再加入二甲基亚砜150μL／孔。置于酶联免疫检测仪(Elx-800型)下测定波长570nm时的光密度(OD)值,比较三组细胞的生长情况。结果重组质粒构建结果：经PCR及测序鉴定确定重组质粒构建成功。干扰效率检测结果：重组质粒转染Panc-1细胞后,ILK基因表达被有效地抑制,干扰效率为74.61%,ILK蛋白的抑制效率为54.66%。MTT实验结果：在0、24h时,三组细胞的A570值没有明显差别；在48、72h和96h时,转染重组质粒的Panc-1细胞的A570值比转染阴性对照质粒和未作处理的Panc-1细胞的A570值明显减小(P<0.01)。结论成功构建了ILK的干扰质粒。ILK siRNA表达质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK的表达。同时,Panc-1细胞的增殖能力下降。提示ILK基因与胰腺癌细胞的恶性行为密切相关可以作为治疗胰腺癌的靶点,其作用机制与细胞信号传导通路有关。RNA干扰是肿瘤基因治疗的有效手段。

全文目录

一、摘要  4-8
  中文论著摘要  4-6
  英文论著摘要  6-8
二、英文缩略语  8-9
三、论文  9-37
  前言  9-10
  第一部分 ILK基因干扰质粒的构建与鉴定  10-18
    材料与方法  10-14
    结果  14-15
    讨论  15-18
  第二部分 ILK基因干扰质粒的转染及其干扰效率测定  18-33
    材料与方法  18-25
    结果  25-28
    讨论  28-33
  第三部分:转染ILK基因干扰质粒对Panc-1细胞增殖的影响  33-36
    材料与方法  33-34
    结果  34-35
    讨论  35-36
  结论  36-37
四、本研究创新性自我评价  37-38
五、参考文献  38-41
六、附录  41-55
  综述  41-53
  在学期间科研成绩  53-54
  致谢  54-55
  个人简介  55

RNAi沉默整合素链接激酶基因对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响及其作用机制的研究

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