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棘孢木霉对植物铁营养的影响及其机制的研究

作　者: 王飞
导　师: 赵蕾
学　校: 山东师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 棘孢木霉 嗜铁素 Fe3+螯合物还原酶 Fe3+还原酶 有机酸
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


铁是几乎所有生物体必需的营养元素之一。虽然土壤中的全铁含量较丰富，但通常状态下是以难溶或不溶性状态存在，植物可直接吸收利用的有效铁含量较低。资料显示，全球范围中，大约25%-30%的土壤有效铁含量严重缺乏。铁在土壤中的溶解度还受pH的影响，酸性土壤中可溶性铁含量相对较高，中性及碱性土壤中主要以不溶性的氧化高铁形式存在。我国约有0.2亿多公顷盐碱地，且有逐年增加的趋势，日益严重的土壤盐碱化进一步降低了土壤中可溶性铁的含量，严重影响了农作物的产量和品质，已成为农业生产中亟待解决的问题。木霉菌（Trichoderma spp.）是一类对植物病原菌具有拮抗作用的植物益生真菌。近年来大量资料显示，除了生防作用之外，木霉菌还能明显促进植物生长，增强植物抵抗生物和非生物胁迫的能力，但其作用机制研究得尚不全面，其中关于木霉菌对难溶性铁的作用以及与植物铁营养之间的关系国内外未见报道。本文结合我国土壤普遍缺铁的现状，从植物根际土壤分离、筛选鉴定了一株高产嗜铁素棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）T6，研究了该木霉菌对土壤中有效铁及嗜铁素含量的影响；通过盆栽试验研究了该木霉菌对植物体Fe3+螯合物还原酶及铁含量的影响；利用金属离子亲和层析法纯化的棘孢木霉菌嗜铁素进行水培实验，证明了嗜铁素在促进植物铁吸收中的作用；棘孢木霉菌T6产生的Fe3+还原酶和有机酸进一步说明棘孢木霉菌T6通过多种机制促进铁的溶解及转化，最后对嗜铁素合成相关基因进行了克隆。具体结果如下：1.采用CAS法对11种木霉菌进行了嗜铁素定性与定量检测，确定了木霉菌T6为高产嗜铁素菌株。该菌还具有多钟植物促生特性，如溶磷、产生吲哚乙酸（IAA）及ACC脱氨酶活性。利用形态和分子生物学手段将该木霉菌株鉴定为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。2.研究了接种棘孢木霉菌T6对土壤中有效铁及嗜铁素含量的影响。结果表明，接种菌株T6的土壤中，有效铁和嗜铁素的含量比对照明显增加，表明菌株T6在土壤中能够产生嗜铁素并提高土壤中有效铁含量，这对促进植物铁吸收具有重要的潜在作用。3.利用盆栽试验研究了棘孢木霉菌T6对盐胁迫条件下黄瓜幼苗的促生以及对黄瓜植株铁含量和根系Fe3+螯合物还原酶活性的影响。测定了水（control）、接菌（T6）、盐+菌（T6+salt）、盐（salt）四种处理对黄瓜幼苗生长的影响及部分生理生化指标。结果显示，在有无盐胁迫的条件下，棘孢木霉菌T6均能显著促进黄瓜幼苗的生长，加菌处理的黄瓜叶片叶绿素、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量均明显提高，植株铁含量和根系Fe3+螯合物还原酶含量显著提高，表明菌株T6能够增强植株铁吸收，且植株铁含量的增加与其促生作用密切相关。4.利用镍离子亲和层析法纯化获得的嗜铁素进行了黄瓜幼苗的水培实验。结果表明，加嗜铁素和难溶性铁化合物的处理，植株幼苗的株高、叶长、根长和鲜重等生理指标明显增高，说明嗜铁素促进了不溶性铁的转化，增强了植株抗盐胁迫的能力。对其嗜铁素类型进行检测的结果表明，棘孢木霉菌株T6产生异羟肟酸型嗜铁素。5.分别利用分光光度法和高效液相色谱技术测定了棘孢木霉菌T6不含嗜铁素发酵液的Fe3+还原酶活性并对有机酸产生情况进行了研究。结果发现，棘孢木霉菌T6能够产生Fe3+还原酶并在发酵液中检测到3种有机酸，即草酸、甲酸和乳酸，说明菌株T6能够通过多种机制促进不溶性铁的转化，从而提高植物对有效铁的吸收利用。6.对嗜铁素合成相关基因进行了初步研究。采用绿木霉（T. virens）嗜铁素合成相关基因Psy1的简并引物在棘孢木霉T6中克隆到长度为661bp的基因片段Tapsy1，该序列已提交GenBank，其登录号为AB907622.1；利用已报道的棘孢木霉菌非核糖体肽合成酶基因（登录号为AY531612.1）设计特异引物，在菌株T6中克隆到长为662bp与所述非核糖体肽合成酶基因序列完全相同的基因片段，为进一步研究嗜铁素的功能奠定了基础。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章 文献综述  12-28
  1 铁元素的重要作用  13-14
    1.1 铁在地壳中的分布及存在状态  13
    1.2 铁是生命体的必需元素  13-14
  2 植物获得铁的机理  14-16
  3 微生物促进植物获得铁的机理  16-23
    3.1 微生物种类  16-17
      3.1.1 植物促生菌  16-17
      3.1.2 菌根真菌  17
    3.2 微生物代谢物对铁的转化及其机制  17-22
      3.2.1 嗜铁素的概念及类型  17-21
      3.2.2 嗜铁素的转运及其作用  21-22
    3.3 Fe~(3+)还原酶及其作用机制  22-23
    3.4 有机酸及其作用机制  23
  4 木霉菌对植物的促生作用  23-24
    4.1 产生嗜铁素  23
    4.2 产生植物激素  23
    4.3 提高养分利用率  23-24
    4.4 木霉菌的生防作用  24
  5 嗜铁素的纯化方法  24-25
  6 嗜铁素合成相关基因的研究  25-26
  7 本研究的立题依据、研究内容及技术路线  26-28
    7.1 立题依据  26
    7.2 研究内容  26-27
    7.3 技术路线  27-28
第二章 高产嗜铁素木霉菌株的分离、鉴定及其生物学特性  28-39
  1 材料与方法  28-33
    1.1 实验材料  28-30
      1.1.1 土壤取样  28
      1.1.2 培养基  28-29
      1.1.3 主要试剂  29-30
    1.2 实验方法  30-33
      1.2.1 木霉菌的分离  30
      1.2.2 具嗜铁素活性的木霉菌的定性分离  30
      1.2.3 高产嗜铁素木霉菌的筛选  30-31
      1.2.4 菌株的生物学特性  31-32
      1.2.5 木霉菌的形态鉴定  32
      1.2.6 木霉菌的分子鉴定  32-33
  2 结果与分析  33-38
    2.1 木霉菌的分离  33
    2.2 产嗜铁素木霉菌的定性分离  33-34
    2.3 高产嗜铁素木霉菌的定量筛选  34-35
    2.4 木霉菌株 T6 的生物学特性  35
    2.5 木霉菌株 T6 的形态鉴定  35-36
    2.6 木霉菌株 T6 的分子鉴定  36-38
  3 讨论  38-39
第三章 棘孢木霉菌 T6 对土壤有效铁和嗜铁素含量的影响  39-44
  1 材料与方法  39-41
    1.1 实验材料  39-40
      1.1.1 供试土样  39
      1.1.2 供试菌株  39
      1.1.3 主要试剂  39-40
    1.2 实验方法  40-41
      1.2.1 土样的前处理  40
      1.2.2 木霉菌悬液的制备  40
      1.2.3 土壤接菌处理  40
      1.2.4 土壤有效铁含量的测定  40
      1.2.5 土壤嗜铁素的测定  40-41
  2 结果分析  41-42
    2.1 土壤有效铁含量的变化  41-42
    2.2 土壤嗜铁素含量的变化  42
  3 讨论  42-44
第四章 高产嗜铁素棘孢木霉菌 T6 对植物的作用  44-55
  1 材料与方法  44-49
    1.1 实验材料  44
      1.1.1 供试菌种  44
      1.1.2 供试植物  44
      1.1.3 培养基质  44
    1.2 实验方法  44-49
      1.2.1 菌悬液的制备  44
      1.2.2 植物种子处理  44
      1.2.3 盆栽实验方法  44-45
      1.2.4 叶片铁含量的测定  45
      1.2.5 根系Fe~(3+)螯合物还原酶活力的测定  45
      1.2.6 叶片叶绿素含量测定  45-46
      1.2.7 叶片 MDA 含量测定  46-47
      1.2.8 黄瓜叶片可溶性糖含量测定  47-48
      1.2.9 叶片可溶性蛋白含量测定  48-49
  2 结果与分析  49-53
    2.1 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜株高的影响  49
    2.2 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜叶片铁含量的影响  49-50
    2.3 棘孢木霉菌 T6 对黄瓜根系Fe~(3+)螯合物还原酶(FCR)含量的影响  50-51
    2.4 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜叶片中叶绿素含量的影响  51
    2.5 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜叶片 MDA 含量的影响  51-52
    2.6 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜叶片可溶性糖含量的影响  52-53
    2.7 棘孢木霉菌 T6 对盐胁迫下黄瓜叶片可溶性蛋白含量的影响  53
  3 讨论  53-55
第五章 棘孢木霉菌 T6 嗜铁素的纯化及其促生机制  55-62
  1 材料与方法  55-57
    1.1 实验材料  55
      1.1.1 供试菌种  55
      1.1.2 供试植物  55
      1.1.3 主要试剂  55
    1.2 实验方法  55-57
      1.2.1 棘孢木霉菌 T6 嗜铁素发酵液的制备  55
      1.2.2 嗜铁素类型的检测  55-56
      1.2.3 嗜铁素的分离纯化  56-57
      1.2.4 黄瓜幼苗的选育  57
      1.2.5 水培试验  57
  2 结果与分析  57-60
    2.1 棘孢木霉菌 T6 嗜铁素类型检测  57-58
    2.2 嗜铁素的分离纯化  58-59
    2.3 棘孢木霉菌 T6 嗜铁素对盐胁迫下黄瓜幼苗的影响  59-60
  3 讨论  60-62
第六章 棘孢木霉菌 T6 铁转化机制及嗜铁素相关基因的克隆  62-72
  1 材料与方法  62-65
    1.1 实验材料  62-63
      1.1.1 供试菌种  62
      1.1.2 培养基  62
      1.1.3 主要试剂  62-63
      1.1.4 主要仪器  63
    1.2 实验方法  63-65
      1.2.1 棘孢木霉菌 T6 对难溶性铁的溶解  63
      1.2.2 Fe~(2+)含量的测定  63
      1.2.3 棘孢木霉菌 T6 Fe3+还原酶活力的测定  63
      1.2.4 棘孢木霉菌 T6 有机酸种类与含量的测定  63-64
      1.2.5 嗜铁素相关基因的克隆  64-65
  2 结果分析  65-70
    2.1 棘孢木霉菌 T6 对难溶性铁的作用  65-66
    2.2 棘孢木霉菌 T6 三价铁还原酶活力的测定  66-67
    2.3 棘孢木霉菌 T6 发酵液有机酸的测定  67-68
      2.3.1 流动相浓度的确定  67
      2.3.2 流动相 pH 值的确定  67
      2.3.3 发酵液中有机酸含量的测定  67-68
    2.4 嗜铁素相关基因研究的初步结果  68-70
  3 讨论  70-72
第七章 结论  72-74
参考文献  74-82
致谢  82-83
攻读学位期间发表论文情况  83

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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