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阳离子聚合物的合成及胍基化修饰对基因转染性能的影响

作　者: 杨慧
导　师: 董伟
学　校: 南京理工大学
专　业: 应用化学
关键词: 胍基化 基因转染 非病毒载体 聚乙烯亚胺 聚β氨酯
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


胍基基团具有很好的细胞膜穿透能力,将其连接到阳离子聚合物上能够帮助聚合物进入细胞,并且能分散聚合物上伯胺的正电荷,降低其毒性,从而提高聚合物的基因转染效率。本文设计合成了一种新型胍基化试剂,用它来修饰三个系列的聚合物,以期提高它们的转染效率。聚乙烯亚胺(PEI)是目前最有效的阳离子非病毒基因载体之一,PEI的转染效率随着其分子量的增加而增加,但是高分子量同样会导致高毒性。本文采用胍基化试剂修饰不同分子量的PEI,探索胍基修饰度以及胍基基团与PEI的连接臂长对转染效率的影响。其次合成了一种多羟基的交联剂,用其交联小胺类单体及低分子量的PEI,并用胍基化试剂对制备出来的聚合物进行修饰,以探讨引入羟基和胍基对聚合物的水溶性,毒性及转染性能的影响。此外,聚p氨酯也是一类非常有效的阳离子非病毒载体,本文通过1,4-丁二醇双丙烯酸酯与5-氨基戊醇的交联制得聚p氨酯,用氨基封端,并用所合成的胍基化试剂修饰,探讨胍基修饰前后聚p氨酯的转染性能的变化。对这些聚合物进行水溶性评价,然后以B16F10细胞为受体,增强绿色荧光蛋白质粒(EGFP)为报告基因进行细胞转染性能实验,筛选出几种转染效果较好的聚合物,其中经胍基化修饰后的2700DaPEI(P10)对B16F10细胞的转染效率达到了82%,与未修饰前相比,提高了近8倍。细胞毒性实验结果表明,经胍基修饰后的聚合物毒性明显降低。粒径实验结果显示,P10/DNA复合物的直径为141-197nm。以上结果表明,在聚合物中引入胍基基团有利于转染性能的提高,P10可以作为安全有效的转染试剂在体外转染实验中使用。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
1 前言  9-19
  1.1 非病毒基因传递的主要障碍  9-12
    1.1.1 细胞吸收的体外障碍  9-12
    1.1.2 基因转染的体内障碍  12
  1.2 非病毒基因载体  12-18
    1.2.1 脂质体介导的基因传递  12-13
    1.2.2 PEI介导的基因传递  13-14
    1.2.3 PEI衍生物介导的基因传递  14-15
    1.2.4 聚β氨酯介导的基因传递  15-16
    1.2.5 富含胍基的聚合物介导的基因传递(guanidinium-rich transporters,GRTs)  16-18
  1.3 本文的研究思路及内容  18-19
2 聚合物的合成及胍基化修饰  19-36
  2.1 试剂与仪器  19-20
    2.1.1 实验试剂  19-20
    2.1.2 实验仪器  20
  2.2 实验内容  20-26
    2.2.1 胍基化试剂的合成  20-21
    2.2.2 PEI衍生物的合成  21-22
    2.2.3 氨基封端聚合物(C-32-NH2)的合成及胍基化修饰  22-24
    2.2.4 聚合物的合成及其胍基化修饰  24-26
  2.3 结果与讨论  26-35
    2.3.1 各种聚合物的水溶性及转染性能评价表  26-28
    2.3.2 胍基化试剂的合成  28-32
    2.3.3 PEI衍生物的合成  32-33
    2.3.4 氨基封端聚合物(C-32-NH2)的合成及胍基化修饰  33-34
    2.3.5 多羟基聚合物的合成及其胍基化修饰  34-35
  2.4 本章小结  35-36
3 聚合物作为质粒DNA转染载体的性能研究  36-47
  3.1 实验材料及仪器  36
  3.2 实验方法  36-39
    3.2.1 pEGFP质粒转化E.coli  36-37
    3.2.2 大量pEGFP质粒的制备  37
    3.2.3 Polymer/DNA复合物的制备  37
    3.2.4 琼脂糖凝胶电泳实验  37-38
    3.2.5 细胞转染实验  38
    3.2.6 EGFP的表达及荧光显微镜观察和流式细胞仪分析  38
    3.2.7 细胞毒性实验  38
    3.2.8 复合物的粒径实验  38-39
  3.3 结果与讨论  39-45
    3.3.1 琼脂糖凝胶电泳实验  39
    3.3.2 细胞转染实验  39-43
    3.3.3 细胞毒性试验  43-45
    3.3.4 复合物的粒径试验  45
  3.4 本章小结  45-47
结论  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-55
附录  55-58

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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