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1目的建立一种可靠、高效、简便的方法,同时测定米屈肼和左卡尼汀在人血浆中的浓度,进行口服米屈肼胶囊后在中国健康志愿者人体内的药物动力学研究,考察其药动学的线性特征,研究米屈肼在人体内对内源性物质左卡尼汀血浆浓度的影响,考察其在人体内的药理作用机制,为临床合理用药提供参考依据。2方法2.1 HPLC-MS/ESI同时测定人血浆中米屈肼和左卡尼汀血浆样品经蛋白沉淀法处理,以卡巴胆碱作为内标（IS）,用氨基色谱柱（Ultimate XB-NH2,4.6mm×250 mm, 5μm）进行分离,以乙腈-30mmol·L(-1醋酸铵水溶液（含0.08%甲酸）（80:20,v/v）为流动相,柱温40℃,流速1.0 mL·min-1,柱后分流比为4:1,HPLC-MS/ESI+法选择性监测被测物质的准分子离子峰。2.2药物动力学研究2.2.1单次给药健康志愿者40名,按随机区组设计,分为5组,每组男女各4名,分别单次口服米屈肼胶囊250,500,1000,1250和1500 mg,给药物前（0h）和给药后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,2.5,3,4,6,9,13,24 h,于肘静脉取血5 ml,置肝素化抗凝试管中,分离血浆存于-70℃冰箱中,以备血药浓度测定。2.2.2多次给药单次给药药动学研究中,500 mg剂量组的受试者,进行多次给药药动学试验。8名受试者每天服药3次（分别于7:00,15:00,23:00时服药）,每次500 mg,连续服药13天后,第14天采血前单次服药500 mg。于第11,12,13天早晨（7:00）给药前采血,测定稳态血药谷浓度,第14天按单次给药药动学试验方法采集血样。2.3多次口服米屈肼对人血浆中左卡尼汀浓度的影响在研究米屈肼多次给药药物动力学的同时,考察多次口服米屈肼对中国健康志愿者血浆中左卡尼汀浓度的影响。在多次给药试验中,第1天服药前空腹采空白血样,第1,3,5,7,9,11,13天,于18:00时（服药前空腹）采血样,考察米屈肼对血浆中左卡尼汀浓度的影响。3结果3.1 HPLC-MS/ESI同时测定人血浆中米屈肼和左卡尼汀米屈肼、左卡尼汀及内标在氨基柱上保留较好,分离完全,米屈肼的线性范围为0.1-30.0μg·mL-1,r=0.9985,最低定量限为0.1μg·mL-1,左卡尼汀的线性范围为0.4-12.8μg·mL-1,r=0.9994,最低定量限为0.4μg·mL-1。左卡尼汀和米屈肼的平均萃取回收率都大于80%,方法回收率在92%-114%之间,批内批间RSD均小于12%。3.2米屈肼的药物动力学3.2.1药动学参数及其在剂量间的差异单次给药口服米屈肼胶囊250,500,1000,1250和1500 mg后,tmax分别为1.22±0.31, 0.97±0.45, 1.22±0.60, 1.19±0.37和1.03±0.41 h,五个剂量组口服达峰时间均相近,差异无统计学意义;t1/2分别为3.61±0.68, 5.28±1.17, 6.09±0.54, 6.07±0.41和6.58±0.91 h,250 mg剂量组的t1/2较小,与其它各组的差异均有统计学意义,500 mg剂量组的t1/2比1500 mg剂量组小,差异有统计学意义,其余各组间t1/2的差异均无统计学意义;MRT0-24分别为7.31±0.89, 8.37±1.08 , 8.72±1.53, 8.69±0.73和8.95±1.13 h,250 mg剂量组的MRT值比1500 mg剂量组小,差异有统计学意义,其余各组间的MRT差异均无统计学意义;V/F分别为39.14±6.80, 54.29±11.83, 65.79±9.38,67.52±7.06和70.70±13.77 L;CL/F分别为7.62±1.23,7.20±1.10,7.51±1.06,7.75±1.02和7.47±1.31 L·h-1;Cmax分别为5.89±0.90,13.75±3.18,30.38±6.31,35.50±13.10和46.27±14.13μg·mL-1;AUC0-24分别为31.97±5.83, 67.80±6.67,127.79±16.89,154.63±19.54和193.33±36.08μg·h·mL-1;AUC0-∞分别为33.57±5.37,70.79±10.05, 135.40±18.84,163.76±21.23和206.45±37.96μg·h·mL-1,米屈肼胶囊在人体内的吸收程度(Cmax,AUC0-24,AUC0-∞)有剂量依赖性。多次口服米屈肼胶囊后,药动学参数t1/2为14.60±2.52 h,MRT0-24为21.40±3.48 h,多次给药组的MRT和t1/2与单次给药组相比明显延长,差异均有统计学意义,说明多次口服米屈肼胶囊后药物在体内的消除减慢,tmax为1.00±0.33 h,Cmaxss为23.97±3.67μg·mL-1,Cminss为9.29±1.62μg·mL-1,（?）为12.85±2.17μg·mL-1,血药浓度波动度DF为1.15±0.25,蓄积系数R为3.29±0.54,多次给药组（一日三次,每隔8小时服一次,每次500 mg,连续服药13天）服药后,AUC0-6ss为89.18±14.97μg·h·mL-1,AUC0-9ss为115.63±19.57μg·h·mL-1,均大于单次给药试验中500 mg剂量组AUC0-∞值70.79±10.05μg·h·mL-1,表明多次口服米屈肼后在体内有明显的蓄积作用。3.2.2药动学参数在性别间的差异采用SPSS软件对受试者单次给药和多次口服米屈肼胶囊后主要药物动力学参数(单次给药:t1/2,tmax,Cmax和AUC0-24;多次给药:t1/2,tmax,Cmax,（?）,DF和AUC0-9ss)进行性别间差异的独立样本t检验,单次给药试验中250 mg剂量组女性受试者的Cmax值比男性高,性别间差异有统计学意义,其他剂量组的药动学参数性别间差异均无统计学意义。部分药动学参数存在性别差异,可能与受试者的身高体重差异和受试者例数较少有关。多次给药试验中各稳态药动学参数性别间均无差异。3.3多次口服米屈肼对人血浆中左卡尼汀浓度的影响8名健康受试者服药前血浆中左卡尼汀的浓度为4.66±0.88μg·mL-1,口服米屈肼后（一日三次,500 mg/次,连续服药13天）,第1,3,5,7,9,11,13天血浆中左卡尼汀的浓度分别为:5.68±0.73, 6.27±0.90, 5.88±0.81, 5.85±0.95, 5.53±0.98,5.60±1.03, 5.26±0.67μg·mL-1 ,服药后左卡尼汀的血浆浓度与服药前相比未见降低。4结论本方法简便准确,适用于米屈肼在体内的药物动力学研究,并可用于考察服用米屈肼后对血浆中内源性物质左卡尼汀浓度的影响。口服米屈肼胶囊在人体内呈非线性药物动力学特征,且多次给药服药在人体内有明显的蓄积作用。多次口服米屈肼胶囊后,人血浆中左卡尼汀的浓度未见发生明显改变。在后续的实验中应考虑饮食因素、适当扩大样本数、增加服药剂量和延长服药时间,并在考察米屈肼对血浆中左卡尼汀浓度影响的同时,考察其对细胞内和尿中左卡尼汀浓度的影响,进一步对米屈肼在心肌缺血患者体内的药理作用机制进行研究。
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