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嗜酸氧化亚铁硫杆菌中硫氰酸酶和丝氨酸乙酰转移酶的表达、纯化及性质研究

作　者: 戴云杰
导　师: 柳建设
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: 嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氰酸酶丝氨酸乙酰转移酶铁硫簇定点突变
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 73次
引　用: 2次
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内容摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是最常见的浸矿细菌,能够利用矿物中的铁与硫作为能源物质,化能自养,好氧嗜酸,革兰氏阴性菌。硫氰酸酶是A.ferrooxidans菌硫氧化系统中重要的一个酶,可以催化硫代硫酸盐中的硫原子到氰化物,生成亚硫酸盐和硫氰酸盐。其在生物学中的作用仍然存在很大的争议,目前公认的硫氰酸酶的作用主要包括:氰化物的解毒作用;在铁硫簇蛋白形成中起辅酶基团;以及在硫胺,硫尿苷或烟碱乙酸胆碱的生物合成中转移硫。硫氰酸酶具有高度的保守性,其亚基呈现单一或者重复衔接结构,并且在亚基的C-末端包含有可参与反应的半胱氨酸,其结构常作为多亚基蛋白质的模型。核酸序列分析发现A.ferrooxidans中硫氰酸酶的C-末端含有一个结合铁硫簇的保守亚基(Cys-XX-Trp-XX-Cys)。本论文从A.ferrooxidans中克隆出硫氰酸酶的基因,表达并用一步亲和层析法纯化出蛋白,表达的蛋白分子量为21KDa。通过紫外-可见光扫描及电子顺磁共振结果证实了硫氰酸酶蛋白含有铁硫簇,我们通过定点突变构建了硫氰酸酶的突变质粒:C92A、C101A、C147A、C197A、C203A。结果证实C92A、C101A、C197A、C203A是硫氰酸酶蛋白结合铁硫簇的重要位点。丝氨酸乙酰转移酶催化乙酰-CoA和L-丝氨酸生成O-乙酰丝氨酸,丝氨酸乙酰转移酶是A.ferrooxidans菌中半胱氨酸合成的关键酶,也是硫循环中重要的一个酶,因为半胱氨酸是硫酸盐同化作用中的第一个含硫氨基酸,也是无机硫进入有机体的必经途径。本文从A.ferrooxidans中克隆丝氨酸乙酰转移酶的基因,表达,并通过一步亲和层析法纯化出蛋白。表达的蛋白分子量为28KDa,具有较高的体外酶活性。据我们所知,这是首次在Escherichia coli中表达来源于A.ferrooxidans的丝氨酸乙酰转移酶。由iscSUA操纵子编码的三个蛋白IscS(半胱氨酸脱硫酶),IscU(支架蛋白)和IscA(铁离子伴侣)参与了A.ferrooxidans铁硫簇的组装,但是机理至今仍不清楚。最近有研究表明硫氰酸酶也能够催化L-半胱氨酸脱硫,为体外组装铁硫簇提供硫。本文通过体外组装铁硫簇实验,以硫氰酸酶代替半胱氨酸脱氢酶,并通过一系列对比试验,初步证实了硫氰酸酶确实能够催化L-半胱氨酸脱硫,为体外组装铁硫簇提供硫。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌中硫氰酸酶和丝氨酸乙酰转移酶的表达、纯化及性质研究

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