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肺炎支原体耐药基因分析及其临床意义

作　者: 周云连
导　师: 陈志敏
学　校: 浙江大学
专　业: 儿科学
关键词: 肺炎支原体肺炎支原体肺炎 23S rRNA基因点突变大环内酯类抗生素
分类号: R725.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是儿童和青少年社区获得性呼吸道感染的常见病原体,主要通过呼吸道传播。MP感染可引起上呼吸道感染、支气管炎、肺炎,也可引起严重的肺外并发症,如免疫性溶血性贫血、脑膜炎、心肌炎、肾炎等。近年来MP肺炎发病率有上升趋势,而且难治性或重症MP肺炎病例增多,对儿童和老年人等免疫低下者造成严重的威胁。MP是介于细胞与病毒之间,无细胞壁的一类原核细胞型生物,因而对影响细菌蛋白质合成的抗生素如大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类等敏感。由于大部分药物对儿童正常生长发育有不良反应,目前大环内酯类药物是治疗儿童肺炎支原体的首选药物。随着大环内酯类药物在临床的广泛应用,其耐药现象也不断出现,难治或重症MP肺炎病例也明显增多,临床上也常有大环内酯类药物治疗无效的病例。MP对大环内酯类抗生素耐药的主要分子基础是红霉素作用靶位23 S rRNA的2063和2064位的点突变。我们应用PCR扩增肺炎支原体23 S rRNA V区域易发生突变的基因片段,并对其扩增产物进行测序,将基因序列与NCBI已登录的MP标准株(M129)23S rRNA基因作比对,并对MP肺炎患儿的临床资料进行统计分析,以了解MP的耐药性以及MP的基因突变和MP肺炎的临床相关性。目的：了解MP耐药基因现状及其与MP肺炎的临床相关性。方法：本研究以2009年4月～2010年4月浙江大学医学院附属儿童医院呼吸科因MP肺炎住院患儿的鼻咽吸出物(NPA)(共235例)作为研究对象,对其进行MP23S rRNA基因检测并测序,并对临床资料进行分析。1.收集患儿的NPA：所有235例患儿均于入院当天采集鼻咽吸出物(NPA),密封送检,标本立即用于测试或保存于-20℃待测,保存期不超过一周,提取MPDNA,进行荧光定量PCR。选取经PCR荧光探针法测定浓度1.0*10^4以上(包括1.0*10^4)NPA作为下一步实验标本,4000转/15分钟离心后取上清于1.5ml离心管中放入-80℃冰箱中冻存备用。2.应用PCR和DNA测序技术直接检测MP 23S rRNA基因：从美国国立生物信息中心(NCBI)检索MP 23S rRNA基因序列,根据我们及国外研究报道的突变热点区即23S rRNA的2063和2064位两侧自行设计PCR引物,对扩增的产物进行电泳检测,用以检测是否存在目的片段。3. MP 23S rRNA基因测序：经电泳检测阳性的标本经乙醇纯化后作双脱氧末端终止法全自动DNA测序,测得序列与NCBI已登录的MP标准株(M129)23SrRNA基因作比对,每次试验设立阳性和阴性对照。4.采集并比较MP 23 S rRNA基因发生突变组和未发生突变组的MP肺炎的性别、年龄、临床表现、并发症、实验室检查结果、胸部X线的特点及治疗情况等。5.统计学处理：采用SPSS16.0统计软件进行分析,计量资料以x±s表示,两组比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05表示为差异有统计学意义。结果：1. NPA-DNA经PCR荧光探针法测定浓度均在1.0*10^4以上(包括1.0*10^4)的标本235例。2. 235例MP标本应用PCR直接检测红霉素作用靶位23 S rRNA基因均为阳性。29例基因序列与NCBI已登录的MP标准株(M129)23 S rRNA基因序列完全相同,无点突变；206例出现了点突变,突变率达到87.7%。3. 206例MP 23 S rRNA基因发生了点突变,其中199例发生2063位A到G的突变,6例发生2063位A到T的突变,1例发生2064位A到G的突变。4.对临床资料分析发现,MP 23 S rRNA基因发生了点突变的MP肺炎与未发生点突变的MP肺炎比较,两者在胸部影像学表现、肺外并发症、平均住院时间、平均发热时间、以及使用大环内酯类抗生素治疗后平均退热时间均存在统计学差异。结论：1. 2009.4—2010.4期间本院呼吸道标本中MP耐药基因(23S rRNA点突变)阳性率达87.7%,其中MP 23S rRNA 2063位点突变率占99.5%。2.携带耐药基因的MP感染者,临床表现更严重,病程更长,更易出现肺外损害。

肺炎支原体耐药基因分析及其临床意义

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