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类黄酮物质对精氨酸激酶和α-葡萄糖苷酶抑制机理及分子对接研究

作　者: 吴学强
导　师: 王晓云
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 精氨酸激酶 α-葡萄糖苷酶抑制机理分子对接 AutoDock
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文利用酶动力学、荧光猝灭和分子对接模拟方法对精氨酸激酶和α-葡萄糖苷酶类黄酮抑制剂进行了研究。精氨酸激酶(AK; EC 2.7.3.3)是在昆虫细胞能量代谢中一个关键酶,探寻精氨酸激酶有效抑制剂,为开发环境友好型杀虫剂提供了一个可能的途径;α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)是生物体内糖代谢过程的重要酶,筛选其抑制剂为临床治疗糖尿病和肥胖提供有效的化学疗法。主要结果如下:1、芦丁对精氨酸激酶抑制机理的研究类黄酮类物质槲皮素和木犀草素等对精氨酸激酶的抑制本实验室已有研究,在此基础上,我们选择了另一种类黄酮物质-芦丁研究其对精氨酸激酶的作用,并使用酶动力学、荧光猝灭和分子对接模拟方法探讨芦丁对精氨酸激酶的抑制机理。实验结果表明,芦丁对精氨酸激酶具有较强的抑制作用,其半抑制浓度IC5 0 = 12.3μM,抑制常数K i = 8μM;抑制动力学研究表明芦丁对酶的抑制属于非竞争抑制类型;芦丁作用过程引起精氨酸激酶荧光强度下降,其猝灭过程为静态猝灭过程,测定芦丁与AK的结合位点数为1(n≈1),在25℃下热力学参数自由能变ΔG = - 31.96 kJ / mol,焓变ΔH = 60.88 kJ / mol,熵变ΔS = 311.54 J / mol·K。从得到的热力学的参数推断芦丁与AK之间的相互作用力主要为疏水作用力。使用分子对接模拟方法对芦丁与AK进行对接模拟,从结构水平上寻找芦丁对酶抑制的机理。使用同源建模方法建立了大分子的三维结构,AutoDock4.0的对接结果表明芦丁的3’,4’-二羟苯基环(B环)与酶的活性中心通过疏水作用力结合,且活性中心Gly64通过氢键与芦丁相结合。结果显示这种相互作用可能是引起芦丁对精氨酸激酶活性抑制的原因。2、槲皮素对α-葡萄糖苷酶抑制机理的研究有研究发现类黄酮类物质木犀草素和白杨素等对α-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用,但并没有阐明其抑制机理。我们选择结构类似的类黄酮物质-槲皮素,研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制机理。研究结果表明槲皮素对α-葡萄糖苷酶也有明显的抑制作用,其半抑制浓度IC5 0 = 0.78 mM,抑制常数K i = 0.412 mM;与芦丁对AK的非竞争抑制不同,槲皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制属于混合型抑制;槲皮素对糖苷酶荧光的猝灭为动态和静态的联合猝灭过程;槲皮素与酶的结合位点数为1( n≈1);在13℃下热力学参数自由能变ΔG = -23.79 kJ / mol,ΔS = 91.57 J / mol·K和ΔH = 2.398 kJ / mol;根据热力学参数的大小,可以推断出槲皮素与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用也是以疏水作用为主。与芦丁对AK的研究相似,尝试使用分子对接的方法阐述槲皮素对酶的抑制机理。柔性对接软件AutoDock4.0对接结果表明槲皮素的3’,4’-二羟苯基(B环)通过疏水作用和氢键与酶的活性中心相结合,结果显示这种相互作用可能是引起槲皮素对α-葡萄糖苷酶有效抑制的主要原因。本论文将结构类似的类黄酮类物质芦丁和槲皮素作为抑制剂来研究其对酶的抑制机理,结果发现虽然类黄酮物质分别与精氨酸激酶和α-葡萄糖苷酶进行作用,但是在对酶抑制作用中芦丁和槲皮素共有的3’,4’-二羟苯基(B环)一样都发挥了重要的作用,这也许就是类黄酮类物质对这两种酶抑制的普遍机理,也为我们设计精氨酸激酶和α-葡萄糖苷酶有效抑制剂提供了一种参考。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-13
1 前言  13-27
  1.1 分子对接模拟方法对酶抑制剂的研究  13-19
    1.1.1 药物作用的基本理论  13-14
    1.1.2 计算机辅助药物设计的概念  14
    1.1.3 计算机辅助药物设计的方法  14-15
    1.1.4 分子对接模拟酶与抑制剂的结合方式  15-19
      1.1.4.1 分子对接  15-16
      1.1.4.2 受体结构分子的准备  16-17
      1.1.4.3 分子对接运算  17-19
  1.2 精氨酸激酶以及其抑制剂的研究背景  19-23
    1.2.1 精氨酸激酶及其生物学功能  19-20
    1.2.2 精氨酸激酶的催化机制和活性中心研究  20-22
    1.2.3 精氨酸激酶抑制剂的研究进展  22-23
  1.3 α-葡萄糖苷酶及其抑制剂的研究  23-26
    1.3.1 α-葡萄糖苷酶及其生物学功能  23-24
    1.3.2 α-葡萄糖苷酶的蛋白质结构与活性中心  24-25
    1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究  25-26
      1.3.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂用途  25
      1.3.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂作用原理  25
      1.3.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂的性质  25-26
    1.3.4 α-葡糖苷酶抑制剂类抗糖尿病药物的发展和研究概况  26
  1.4 本实验研究目的和意义  26-27
2 材料与方法  27-39
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 酶与化学试剂  27
    2.1.2 主要试剂和仪器设备  27
  2.2 实验方法  27-39
    2.2.1 精氨酸激酶样品准备和酶活性测定  27-28
    2.2.2 α-葡萄糖苷酶样品准备和酶活性测定  28
    2.2.3 酶动力学分析  28-30
      2.2.3.1 使用动力学方法判断可逆和不可逆抑制作用  28-29
      2.2.3.2 通过抑制作用动力学判断抑制类型  29-30
    2.2.4 通过荧光猝灭测定酶与抑制剂的结合常数及结合位点数  30-34
    2.2.5 热力学参数的计算  34
    2.2.6 分子对接模拟计算  34-39
      2.2.6.1 小分子化合物和大分子受体三维结构分子的准备  34-36
      2.2.6.2 抑制剂与酶分子的对接研究  36-39
3 结果和分析  39-59
  3.1 芦丁作为精氨酸激酶抑制剂的研究  39-48
    3.1.1 芦丁对AK 活性的抑制效应  39-40
    3.1.2 芦丁对AK 活性抑制类型的测定  40-41
    3.1.3 通过荧光猝灭手段测定芦丁与AK 的结合常数和结合位点数  41-45
      3.1.3.1 对AK 的荧光猝灭研究  41-44
      3.1.3.2 芦丁与AK 结合常数和结合位点数目的测定  44-45
    3.1.4 芦丁-AK 体系热力学参数的计算及相互作用力类型的判断  45-46
    3.1.5 芦丁与AK 的分子对接研究  46-48
  3.2 槲皮素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究  48-59
    3.2.1 槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效应  48-49
    3.2.2 槲皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学  49-51
    3.2.3 荧光猝灭方法测定槲皮素与葡萄糖苷酶的结合常数和结合位点数  51-55
    3.2.4 槲皮素-葡萄糖苷酶体系热力学参数及相互作用力类型的判断  55
    3.2.5 槲皮素与α-葡萄糖苷酶的对接研究  55-59
4 讨论  59-62
  4.1 类黄酮物质与酶相互作用的动力学研究  59-60
    4.1.1 芦丁对精氨酸激酶活性的抑制和荧光猝灭现象  59
    4.1.2 槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制及荧光猝灭现象  59-60
  4.2 分子对接方法进一步探索酶与抑制剂之间的作用机理  60-62
    4.2.1 芦丁与AK 之间的相互作用与抑制机理  60-61
    4.2.2 槲皮素与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用与抑制机理  61-62
5. 结论  62-63
参考文献  63-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的论文  75

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