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大肠癌干细胞相关基因LYRM2的克隆、原核表达、抗体制备

作　者: 陈志刚
导　师: 黄建
学　校: 浙江大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 大肠癌干细胞 LYRM2 基因克隆 原核表达 单克隆抗体
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


LYRM2（LYR motif containing 2）基因定位于人类第6号染色体的长臂15区,在人类、猩猩、小鼠、犬、鸡、大鼠和斑马鱼中高度保守。这个基因包含4种转录产物,仅仅转录子1能翻译出结构蛋白,其他三种均因缺少翻译起始密码而不能启动翻译过程。LYRM2基因编码88个氨基酸,属于LYR复合体1超家族,这个家族被认为可能参与了真核细胞NADH复合体的组成,具体功能如何尚待研究。在我们的前期研究中,通过全基因组表达谱芯片比较结肠癌肝转移来源CD133+细胞与CD133-细胞,发现LYRM2在CD133+细胞中高表达。CD133作为干细胞一种重要的表面标记,已经在各种实体瘤中被广泛应用。但是关于LYRM2蛋白的结构和功能方面尚未见文献报道。为了进一步研究LYRM2基因及其蛋白在大肠癌干细胞中的作用,获得该蛋白的抗体成为当前的首要任务。本研究采用RT-PCR的方法从人肠癌细胞系SW480中克隆得到LYRM2基因的编码序列（CDS Sequence）,经测序证实正确后,将该段序列克隆入原核表达载体PET-43.1b中,诱导表达得到分子量约为72kDa融合蛋白。将该单克隆细菌株利用发酵工艺扩增得到大量融合蛋白,之后利用肠激酶酶切和Ni柱分离纯化目的蛋白,然后将获得的纯化蛋白免疫小鼠,获得了单克隆抗体,为下一步研究LYRM2的功能奠定了基础。实验目的：通过克隆LYRM2基因编码序列,构建原核表达载体并纯化出LYRM2蛋白,制备单克隆抗体,而为下一步研究LYRM2基因及其蛋白在大肠癌干细胞中的作用与调控机制提供重要的工具。实验方法：1.从肠癌细胞系SW480提取总RNA,根据GeneBank（NM020466.4）中的LYRM2 CDS设计引物,经逆转录合酶链式反应扩增出的编码区序列,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-43.1b中、测序鉴定。2.测序正确后将重组后的质粒转化大肠杆菌,用异丙基硫代-β-D-半乳糖ITPG)诱导表达融合蛋白,确定目的基因的表达情况后,利用发酵工艺进一步大量表达,并经Ni柱纯化后获得高纯度的融合蛋白。3.将获得的融合蛋白用肠激酶酶切和Ni柱分离纯化目的蛋白之后免疫小鼠,将骨髓瘤细胞SP2/02Ag14与小鼠脾脏细胞融合,制备鼠的单克隆抗体,运用ELISA和Western-blot检测抗体测抗体特异性。实验结果：从人肠癌细胞系SW480提取总RNA,经RT-PCR后,获得一条约260bp的DNA电泳条带,产物与pET-43.1b载体连接并转化大肠杆菌后得到阳性克隆,经BLAST分析证实与LYRM2基因的CDS （NM020466.4）序列完全一致。将载有目的片段的pET-43.1b重组表达载体转化大肠杆菌,诱导表达得到分子量约为72kDa融合蛋白。利用发酵工艺进一步大量表达融合蛋白,并经Ni柱纯化后获得高纯度的融合蛋白。将融合蛋白用肠激酶酶切和Ni柱分离得到一大小为15kDa的LYRM2蛋白,用该蛋白免疫Bal-B/C nu/nu,并将骨髓瘤细胞SP2/02Ag14与小鼠脾脏细胞融合获得杂交瘤细胞,制备鼠的单克隆抗体。ELISA和Western-blot检测显示原核表达的蛋白可与单克隆抗体特异性结合,且随着抗体稀释而变化。实验结论：成功构建了pET-43.1b-LYRM2原核表达载体,得到高纯度的目的蛋白,获得了抗LYRM2单克隆抗体,经western blot检测证实所得的抗体具有较高的特异性,为进一步研究LYRM2的功能与调控提供了实验工具。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 大肠肿瘤
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