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培养与免培养结合研究三疣梭子蟹养殖池塘细菌多样性

作　者: 孙苏燕
导　师: 张德民
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物
关键词: 三疣梭子蟹海水养殖塘微生物群落弧菌 16S rDNA基因
分类号: S968.252
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国海产经济蟹类,近年来浙江省沿海的三疣梭子蟹养殖业发展非常迅速,但是病害发生频繁,成为其稳产、高产的主要限制瓶颈。养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的菌群结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义,本文采用培养法和免陪养法对三疣梭子蟹养殖池塘细菌的群落组成进行了研究。首先,对宁海县明港东坝三疣梭子蟹养殖塘水体中的可培养细菌进行了为期3个月(7、8、9月份)的跟踪调查,每个月采一次样,共分离纯化198株异养细菌,根据其菌落形态特征分为15个类群;16S rDNA基因的变性梯度胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)带型和基因序列分析表明,198株异养细菌分属于4个门,5个纲,16个科,26个属,56个种,81个发育型,主要属于γ-变形杆菌纲( Gammaproteobacteria, 130株, 63.1%)和芽孢杆菌纲(Bacilli,47株,22.8%)。通过比较7、8、9月份的异养细菌群落组成发现水体中的异养细菌群落类群演替规律如下:(1)81个发育型中没有一个种或发育型同时出现在3个月份;(2)同个种或发育型在2个月份中同时出现的有7个科8个属,其余9个科18个属仅在一个月份中出现。对7-11月份三疣梭子蟹养殖水体中的弧菌数量及其群落演替进行了调查,结果表明,V. natriegens的大量出现不仅与病害无关,还可能具有重要的生态功能,而V. harveyi的大量出现可能与病害发生相关。其次,应用不依赖于培养的分子生物学技术——构建16S rDNA克隆文库的方法调查了同一三疣梭子蟹养殖塘水体中7月份和8月份细菌的群落结构。通过2个16S rDNA克隆文库的构建,共获得了131条有效序列。相对于培养法而言,2个文库中细菌的多样性更丰富,可归属为5个门(变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、CFB类群(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)以及厚壁菌门(Firmicutes)),优势类群为蓝细菌纲和γ-变形杆菌纲。最后,我们对健康和发病的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)养殖水体及其体液的弧菌数量和群落结构进行了比较研究。共分离得到72株弧菌可分为7个菌落类群,7个种,11个发育型。病害塘养殖水体的弧菌数量与健康塘相比,没有较大变化,但是蟹体体液中的弧菌群落结构变化明显,病害蟹弧菌平均数量较健康蟹增加了2个数量级,但弧菌种属多样性明显减少,健康蟹体液主要是4个种5个发育型(V.alginolyticus、V.campbellii、V.natriegens和V. harveyi(Ⅱ、Ⅲ)),而病害塘主要是1个种2个发育型(V.harveyi(Ⅳ)和(Ⅴ)),且V. harveyi(Ⅰ)的数量大大增加,成为优势发育型。这些结果似乎表明三疣梭子蟹发病与养殖水体中的弧菌数量及群落结构关系不大,而与蟹体中的弧菌数量及群落结构关系密切,可能与弧菌的个别种甚至同个种的个别发育型的优势生长有关。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-12
1 海洋微生物多样性的研究进展  12-23
  1.1 海洋微生物多样性的概念  12-13
  1.2 海洋微生物多样性的研究方法  13-19
    1.2.1 基于纯培养技术的研究方法  13-14
    1.2.2 基于分子生物学技术的研究方法  14-19
  1.3 海水养殖环境微生物多样性的研究现状  19-21
    1.3.1 微生物群落结构  19-20
    1.3.2 病原微生物  20-21
  1.4 本论文的研究目的及内容  21-23
2 三疣梭子蟹养殖塘水体不同月份异养细菌群落比较研究  23-56
  2.1 前言  23-24
  2.2 材料和方法  24-28
    2.2.1 采样点概况  24
    2.2.2 样品的采集  24
    2.2.3 异养细菌的分离、纯化  24
    2.2.4 异养细菌基因组DNA 的提取  24-25
    2.2.5 PCR-DGGE 分析  25-27
    2.2.6 16S rDNA 序列测定及系统发育学分析  27-28
    2.2.7 多样性指数分析  28
  2.3 结果  28-51
    2.3.1 异养细菌菌落分群  28-31
    2.3.2 七月份异养细菌群落结构  31-36
    2.3.3 八月份异养细菌群落结构  36-41
    2.3.4 九月份异养细菌群落结构  41-51
  2.4 讨论  51-54
    2.4.1 菌落类群组成的变化  51-52
    2.4.2 异养细菌物种多样性及其演替  52-54
  2.5 小结  54-56
3 免培养法研究三疣梭子蟹养殖塘细菌多样性  56-80
  3.1 前言  56
  3.2 材料和方法  56-60
    3.2.1 样品的采集  56-57
    3.2.2 样品总DNA 的提取  57-58
    3.2.3 PCR 扩增16S rDNA 全序列  58
    3.2.4 16S rDNA 克隆文库的构建及测序  58-59
    3.2.5 基于16S rDNA 的系统发育学分析  59-60
  3.3 结果  60-74
    3.3.1 七月份克隆文库分析  60-66
    3.3.2 八月份克隆文库分析  66-74
  3.4 讨论  74-78
  3.5 小结  78-80
4 三疣梭子蟹养殖塘水体弧菌群落演替的初步研究  80-90
  4.1 前言  80-81
  4.2 材料和方法  81-82
    4.2.1 样品采集  81
    4.2.2 细菌的分离、纯化  81
    4.2.3 细菌基因组DNA 的提取及16S rDNA 基因的PCR 扩增  81
    4.2.4 细菌16S rDNA 序列的测定及系统发育学分析  81-82
  4.3 结果  82-86
    4.3.1 养殖塘水体异养细菌总数及发病概况  82
    4.3.2 水体弧菌数量及群落演替分析  82-85
    4.3.3 蟹体弧菌群落组成分析  85-86
  4.4 讨论  86-89
  4.5 小结  89-90
5 三疣梭子蟹养殖水体及其体液的弧菌群落结构比较研究  90-100
  前言  90-91
  5.1 材料和方法  91-92
    5.1.1 采样点概况  91
    5.1.2 样品采集  91
    5.1.3 弧菌的分离、纯化  91
    5.1.4 弧菌基因组DNA 的提取及16S rDNA 基因的PCR 扩增  91-92
    5.1.5 弧菌16S rDNA 序列的测定及系统发育学分析  92
  5.2 结果  92-96
    5.2.1 弧菌数量分析  92
    5.2.2 弧菌菌落类群分析  92-94
    5.2.3 弧菌16S rDNA 鉴定及系统发育分析  94-96
  5.3 讨论  96-99
  5.4 小结  99-100
6 结论与创新  100-103
  6.1 结论  100-101
    6.1.1 培养与免培养法研究三疣梭子蟹养殖塘水体细菌的群落结构  100
    6.1.2 养殖水体中细菌群落的演替  100
    6.1.3 梭子蟹养殖水体中弧菌的演替规律  100-101
    6.1.4 梭子蟹养殖水体及其体液的弧菌群落结构  101
  6.2 创新  101-103
    6.2.1 研究方法  101
    6.2.2 研究内容  101-103
参考文献  103-108
在学研究成果  108-109
致谢  109

培养与免培养结合研究三疣梭子蟹养殖池塘细菌多样性

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