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中国浓香型白酒窖池微生物生态研究

作　者: 向文良
导　师: 张文学
学　校: 四川大学
专　业: 应用化学
关键词: 窖池微生物生态 16S rDNA基因序列分析 原核微生物系统发育分析 窖池环境生态因子分析
分类号: TS262
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


利用PBS缓冲液富集窖池出窖醅样中的微生物菌体，通过玻璃珠法破碎菌体细胞，提取染色体DNA。然后在分子分类水平上，运用PCR扩增技术、质粒重组技术和克隆技术构建窖池原核微生物基因组文库，利用末端终止法测定16S rDNA基因全序列。根据与基因数据库中相似菌群的16S rDNA序列同源性比较和各菌群的系统发育分析建立系统发育树图。结果发现：当浓香型窖池中酒醅发酵60d后，由于生存环境恶劣窖池中发酵前期和中期中常见的微生物已不复存在，而仅存一些耐受力强的微生物。这些微生物分布为：上层分布有细菌和古菌。在系统发育树图上，上层细菌主要分为6个群系：TM7 phylum sp群、低G+C％革兰氏阳性Lactobacteria群、低G+C％革兰氏阳性Clostridiaceae群、低G+C％革兰氏阳性Paenibacillaceae群、高G+C％革兰氏阳性Corynebacteria群、革兰氏阴性Bacteroidete菌群。其中Lactobacteria群在窖池约占上层醅样细菌的36％。上层古菌主要为产甲烷菌，系统发育图上分为亲缘关系极近的两簇：Methanoculleus oldenburgensis和Methanoculleus olentangyi为一簇，Methanospirillum hungatei为一簇。它们都属于Methanomicrobiaceae属，其中前者和后者分别约占上层古菌的80％和20％。在窖池中心部位仅有细菌分布，在系统发育树图上主要分为4个菌群，高G+C％革兰氏阳性Actinobacteria群、低G+C％革兰氏阳性Lactobacteria群、Fusobacteria群、革兰氏阴性Protebacteria群，其中，β-Protebacteria群约占窖池中层醅样中原核微生物的80％。下层醅样中无细菌分布，仅有一种古菌，即Methanoculleus oldenburgensis。四川大学了吹_l:学位论文 在窖池原核微生物系统发育分析基础之上，进一步对不同空间位置微生物生存环境的生态因子作了动态分析。分析结果表明:温度在窖池酒酷入窖后0~7d阶段，上层由27’C降到23℃左右，中层由16℃升到23左右，下层基本维持在入窖时的22℃。发酵约14天左右各层温度达到最高约32~34℃，以后一直维持到主发酵期结束刁‘开始逐渐缓慢下降。PH值在窖池中相对稳定，各层一般维持在pH3 .5左右，而总酸却随发酵时间的增长而升高，窖池中底层酸度高于其它各层。出窖时各层酸度最高，约35度。总糖在酒酷中一直呈下降趋势，其中各层含量下降主要发生在主发酵阶段。上层由发酵初的约28%降到20%左右，中层由初期的约35%降到23%左右，下层由于可发酵糖已利用完全，因此在整个过程中下层总搪除约有波动外皆维持在发酵初的17%左右。还原糖在发酵初期各层增加最快，各层其含量也达到最高，上层、中层和下层平均分别达到86%、6.2%和9.5%左右。进入主发酵期，各层的还原糖含量迅速降低，主发酵期后阶段各层还原糖略有上升，但是到主发酵结束后还原糖随发酵时间的推移，逐渐下降至最低，上层平均约1.5%，中层平均约3.7%，下层平均约4.9%。乙醇是酒酷发酵过程中微生物生命活动关键的限制因素之一。在主发酵结束后，上层酩样中乙醇平均含量约为5.0%，中层约为5.5%，下层约为5.3%。窖池中水分含量在发酵过程中基本维持平衡，上层和中层约55%，‘下层约60%。粗蛋白和醋在发酵过程中呈波动变化，粗蛋白一般维持在5%左右。醛在发酵初期7的左右含量最高，每1009酷样中平均上层约含92mg、中层约含76mg、一卜层约含1 00mg。在主发酵期醛含量迅速降低，至主发酵结束是培养中醛含量基本保持在每1009酷样含20一30mg。 窖池微生物生态系统是窖池微生物和窖池特定环境相互作用的一个动平衡系统。分析微生物在窖池中的区系分布和窖池中微生物菌群的系统发育，弄清影响窖池微生物分布及演变的各种环境因素，对于理解发酵过程中的生化代谢途径，建立窖池微生物生态数据库，实现窖池微生态系统的人工模拟和名优白酒的扩大再生产具有重要意义。 关键词:窖池微生物生态、165 rDNA基因序列分析、原核微生物系统发育分析、窖池环境生态因子分析

全文目录


1 绪论  11-22
  1.1 前言  11-12
  1.2 国内外微生物生态学研究现状和发展趋势  12-14
  1.3 中国浓香型白酒窖池微生物生态研究的现状  14-20
    1.3.1 国内外关于曲药微生物生态的研究概况  15-17
    1.3.2 窖泥微生物生态的研究概况  17-18
    1.3.3 发酵过程中糟醅微生物生态的研究概况  18-20
  1.4 中国浓香型白酒窖池微生物生态研究的意义及发展趋势  20-21
    1.4.1 微生物菌种资源数据库及菌种基因库的建立和完善  20
    1.4.2 发酵过程中主要生化代谢途径的认识和分析  20-21
    1.4.3 窖池微生态数据库的建立和微生态系统的人工模拟  21
  1.5 本硕士论文的研究内容  21-22
2 窖池原核微生物系统发育分析  22-71
  2.1 前言  22-26
  2.2 菌体的富集和染色体DNA的制备  26-30
    2.2.1 引言  26
    2.2.2 实验条件  26
    2.2.3 实验方法  26-27
      2.2.3.1 菌体的富集  26
      2.2.3.2 DNA提取  26-27
    2.2.4 分析方法  27-28
      2.2.4.1 DNA浓度的测定  27
      2.2.4.2 DNA片段大小测定  27-28
    2.2.5 结果与讨论  28-30
      2.2.5.1 质粒的DNA浓度  28-29
      2.2.5.2 DNA片段的大小  29-30
  2.3 16S RRNA目的基因的PCR扩增  30-37
    2.3.1 引言  30-32
    2.3.2 试验条件  32-33
      2.3.2.1 试剂  32
      2.3.2.2 仪器  32-33
    2.3.3 实验方法  33
      2.3.3.1 目的基因的PCR扩增反应  33
    2.3.4 分析方法  33-34
    2.3.5 结果与分析  34-37
      2.3.5.1 模板最佳添加量确定  34-37
      2.3.5.2 PCR片段电泳结果分析  37
  2.4 16S RRNA／DNA基因的克隆分析  37-52
    2.4.1 引言  37
    2.4.2 试验材料  37-38
    2.4.3 实验方法  38-41
      2.4.3.1 培养基制备  38
      2.4.3.2 连接反应(Ligation)和重组DNA的转化  38-39
      2.4.3.3 重组菌落的遗传表型筛选  39-40
      2.4.3.4 重组大肠杆菌的扩大培养  40
      2.4.3.5 重组质粒DNA结构特征的鉴定  40-41
    2.4.4 结果与讨论  41-52
      2.4.4.1 质粒和宿主的选折  41-42
      2.4.4.2 DNA的体外连接  42-44
      2.4.4.3 重组子导入受体细胞  44-45
      2.4.4.4 重组子的筛选与鉴定  45-52
  2.5 DNA序列的测定  52-70
    2.5.1 引言  52-53
    2.5.2 实验方法  53-54
      2.5.2.1 材料  53
      2.5.2.2 方法  53-54
    2.5.3 分析方法  54-55
      2.5.3.1 DNA碱基序列的同源性分析  54
      2.5.3.2 系统发育树图的绘制  54-55
    2.5.4 结果与讨论  55-70
      2.5.4.1 模版质粒DNA浓度  55-59
      2.5.4.2 DNA测序反应中重组质粒模板的加入体积  59-60
      2.5.4.3 核苷酸顺序的阅读及分析  60-65
      2.5.4.4 系统发育分析  65-70
  2.6 小结  70-71
3 窖池环境生态因子分析  71-100
  3.1 前言  71
  3.2 温度  71-74
    3.2.1 引言  71-72
    3.2.2 试验方法  72
    3.2.3 结果与讨论  72-74
  3.3 酸度的分析  74-78
    3.3.1 引言  74-75
    3.3.2 试验方法  75
      3.3.2.1 试样预处理  75
      3.3.2.2 测定方法  75
    3.3.3 分析方法  75-76
      3.3.3.1 0.1mol／L NaOH溶液的标定  75
      3.3.3.2 样品总酸度的测定  75-76
      3.3.3.3 计算方法  76
    3.3.4 结果与讨论  76-78
  3.4 原糖和总糖  78-84
    3.4.1 前言  78-79
    3.4.2 试验方法  79-80
      3.4.2.1 试剂  79
      3.4.2.2 仪器  79
      3.4.2.3 测定方法  79-80
    3.4.3 分析方法  80-81
      3.4.3.1 标准曲线的绘制  80-81
      3.4.3.2 酒醅中还原糖的计算：  81
      3.4.3.3 酒醅中总糖的计算：  81
    3.4.4 结果与讨论  81-84
  3.5 乙醇含量的分析  84-90
    3.5.1 前言  84-85
    3.5.2 试验方法  85
      3.5.2.1 材料  85
      3.5.2.2 方法  85
    3.5.3 分析方法  85-88
      3.5.3.1 乙醇含量标准曲线的绘制  85-87
      3.5.3.2 标准曲线的绘制  87-88
    3.5.4 结果与讨论  88-90
  3.6 水  90-92
    3.6.1 前言  90
    3.6.2 实验方法  90
    3.6.3 分析方法  90
    3.6.4 结果与讨论  90-92
  3.7 醛和酯  92-96
    3.7.1 前言  92
    3.7.2 试验方法  92-94
      3.7.2.1 试剂  92-93
      3.7.2.2 方法  93-94
    3.7.3 结果与讨论  94-96
  3.8 粗蛋白的测定  96-98
    3.8.1 前言  96-97
    3.8.2 试验方法  97
    3.8.3 分析方法  97
    3.8.4 结果与讨论  97-98
  3.9 小结  98-100
4 结论  100-102
参考文献  102-106
完成论文目录  106-107
声明  107-108
致谢  108

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 各种酒及其制造
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