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无机砷对核转录因子Nrf2和血红素单加氧酶HO-1的诱导作用

作　者: 张新玉
导　师: 孙贵范
学　校: 中国医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: Chang liver细胞株亚砷酸钠活性氧自由基氧化应激谷胱甘肽核转录因子Nrf2 血红素单加氧酶HO-1 BSO
分类号: R599
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的砷是地壳中一种常见类金属元素,广泛分布于环境中。人类在生产生活中通过食物、饮水、呼吸等途径接触到砷化物,流行病学调查和实验室研究显示急性或慢性砷暴露都会对机体产生损伤。到目前为止,全球已有接近2亿人处在饮用高砷水的危害中。慢性饮水型砷暴露可以导致皮肤角化、色素脱失和沉着、神经系统损伤、心血管疾病和各器官肿瘤。目前,砷中毒发病机制尚不清楚,但近年来,在众多机制研究中,砷诱发活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）产生并导致氧化损伤的学说受到越来越多的关注。有人群资料证实慢性砷暴露可引起体内氧化应激反应,ROS生成增多;并且低浓度的ROS作为细胞内反应的信号中间传递体,通过介导体内的某些氧化应激敏感性的信号转导途径而发挥重要作用。目前,核转录因子（transcription factor NF-E2-related factor 2,Nrf2）在调控氧化应激中所起的作用受到越来越多的关注。核转录因子Nrf2,是锌指蛋白（bZIP）Cap‘n’Collar家族中的一员,在激活很多编码抗氧化酶和Ⅱ相药物代谢酶表达的过程中起着重要的调控作用,其调控作用通过抗氧化反应元件（antioxidantresponse elements,AREs）实现。在众多的被Nrf2激活的抗氧化物酶中,血红素单加氧酶（heme oxygenase 1,HO-1）的诱导表达受到广泛的关注,其在增强机体的抗氧化能力方面起着重要的作用。HO-1是HO热休克蛋白中的一种,在正常组织中表达甚微,只有在氧化应激情况下才大量产生,增加机体抵抗力,维持机体生存。综上所述,本研究以NaAsO₂为暴露因素,以正常人肝细胞株Chang liver为靶细胞,观察无机砷对Chang liver细胞活力、细胞中ROS、细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）等氧化应激指标的影响作用及细胞中核转录因子Nrf2及其调控的下游靶基因HO-1蛋白表达的影响作用;以及加入GSH合成的抑制剂丁硫氨酸亚矾胺（_L-buthionine-[S’R]-sulfoximine,BSO）后对上述指标表达的影响作用,从而为砷中毒的发病机制研究提供一定的依据。方法一、实验方法（一）细胞培养Chang liver细胞系购自中科院上海细胞库（ZN1003）。细胞常规培养于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清,1×10⁵U/L青、链霉素）,5%CO₂、37℃条件下培养。待细胞达到80%-90%融合时,以1:3进行传代。（二）细胞增殖活力检测采用Alamarblue法。实验分组为:单纯染砷组、BSO预处理组。用酶标仪测定各孔的吸光度值,计算Alamarblue的还原百分率,还原率越高,表示细胞增殖活力越强。（三）BSO预处理后细胞内GSH含量的测定GSH试剂盒（DTNB）法测定细胞内GSH含量,考马斯亮蓝法测定细胞内蛋白以校正GSH含量。实验分组为单纯染砷组和BSO预处理组。（四）细胞内ROS测定采用2’,7’-二乙酰二氯荧光素（DCFH-DA）法测定细胞内ROS含量。实验分组为单纯染砷组和BSO预处理组。（五）免疫印记（western blotting）实验1、蛋白提取（Nrf2和HO-1蛋白）实验分组为:单纯染砷组,BSO预处理组。细胞裂解后提取蛋白,考马斯亮蓝法对蛋白定量。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）3、转膜采用半干转方法将蛋白转印至PVDF膜上（216 mA,1 h）。4、杂交杂交抗体浓度为:一抗浓度:Nrf2（1:1000）、HO-1（1:1000）和内参β-actin（1:5000）;二抗浓度都为:1:5000。5、化学发光反应按照ECL试剂盒操作步骤,用凝胶成像分析仪曝光显像,凝胶成像分析系统进行蛋白灰度值分析,结果用实验组的平均灰度值与对照组的平均灰度值的相对值表示。二、统计学处理采用SPSS 11.5统计软件进行分析,组与组之间用两组独立样本t-test;组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,两两比较采用LSD-t检验。结果（一）细胞形态改变染砷24 h条件下,对照组细胞生长状态良好,细胞呈典型的上皮细胞形态,为扁平的三角或多角形,胞质近中央处有一个或两个圆形的细胞核,细胞形态一致,界限清晰;10μmol/L组部分细胞收缩变形、体积变小,失去正常细胞间的紧密连接,少量细胞脱离培养基质而悬浮;50μmol/L组细胞收缩变圆、变形、变小、细胞数量减少,间隙增大,多数细胞脱离培养基质、悬浮于培养液;100μmol/L组细胞脱壁现象更加严重,细胞多数变圆,与对照组相比,仅可见小部分细胞贴壁。（二）细胞增殖活力的改变1、NaAsO₂单独作用:各浓度的NaAsO₂溶液作用于细胞24 h后,Alamarblue还原率降低,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）,且随着染砷剂量的增加,还原率也逐渐降低,100μmol/L组,还原率最低,为对照组的0.35±0.06倍。2、BSO预处理对Chang liver细胞活力的影响:3 mmol/L BSO预处理12 h后,染砷24 h,细胞还原率与同组单独染砷相比还原率均明显降低（P＜0.01）。（三）BSO预处理对Chang liver细胞中GSH含量的影响1、2.5和5μmol/LNaAsO₂溶液单独作用24 h,细胞内GSH含量逐渐增高,NaAsO₂溶液10μmol/L组GSH含量低于对照组,分别与对照组相比差异有统计学意义（p＜0.01）;BSO预处理12 h再加入NaAsO₂溶液处理24 h后,细胞内GSH与同组的单独染砷组相比明显降低且差异有统计学意义（p＜0.01）。（四）BSO预处理对Chang livet细胞内ROS的影响BSO预处理12 h,加入各浓度的NaAsO₂溶液处理24 h,细胞内ROS含量明显升高。与同组单独NaAsO₂溶液处理组相比明显升高,差异有统计学意义（p＜0.01）。（五）NaAsO₂对细胞中核转录因子Nrf2蛋白表达的活化作用细胞染毒0-24 h后,NaAsO₂能够持续诱导细胞内核转录因子Nrf2蛋白表达增加,5μmol/L NaAsO₂溶液染毒12 h,10μmol/L NaAsO₂溶液染毒2、6、12 h的核转录因子Nrf2蛋白表达均强于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。且核转录因子Nrf2蛋白表达的活化具有时间相关性,即在NaAsO₂溶液染毒12 h时核转录因子Nrf2蛋白表达的活化出现高峰,而后仍然维持在高于对照组的水平。（六）NaAsO₂对细胞中HO-1蛋白表达的活化作用NaAsO₂染毒浓度为10μmol/L,染毒时间为6 h、12 h和24 h组,细胞内HO-1蛋白含量逐渐增加,与对照组（0 h）相比差异有统计学意义（p＜0.05或p＜0.01）;5和10μmol/L组,6 h、12 h和24 h各组之间,随着染毒时间的增加,细胞内HO-1蛋白表达逐渐增加,差异有统计学意义（p＜0.01）。结论（一）砷能够使细胞内产生氧化应激,进而使细胞内Nrf2蛋白表达增强,从而引起其下游靶基因HO-1蛋白的表达增加,使细胞抗氧化能力增强。（二）GSH合成的抑制剂BSO能够使Chang liver细胞内氧化应激水平增加,核转录因子Nrf2和HO-1蛋白表达增强,说明了细胞内巯基水平能够拮抗砷引起的细胞毒性作用。

全文目录

一、摘要  4-15
  中文论著摘要  4-9
  英文论著摘要  9-15
二、英文缩略语  15-16
三、论文  16-34
  前言  16-18
  材料与方法  18-22
  结果  22-31
  讨论  31-33
  结论  33-34
四、本研究创新性自我评价  34-35
五、参考文献  35-38
六、附录  38-48
  综述  38-46
  在学期间科研成绩  46-47
  致谢  47-48
  个人简介  48

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