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TIZ与卵巢癌关系的基因水平研究

作　者: 赵冰冰
导　师: 李力
学　校: 广西医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: TIZ 卵巢癌 RT-PCR 真核表达载体 细胞功能 RNAi shRNA表达载体
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


卵巢癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤,死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中居首位,并有上升趋势。因卵巢生理解剖位置处于盆腔深部,早期卵巢癌患者缺乏典型的临床症状,大部分卵巢癌患者发现时病变已发展到晚期。因此在分子生物学水平研究卵巢癌变机理及恶性生物学行为,寻找早期诊断方法,探索有效的治疗手段,对于改善患者的预后,提高的生存率,降低死亡率有重要意义。本实验室前期应用SEREX技术从血清中筛选出卵巢癌相关抗原TIZ,TIZ蛋白在卵巢癌患者血清表达升高,TIZ蛋白联合其它血清标志物有助于提高诊断的敏感性和特异性。为了从基因水平进一步了解TIZ与卵巢癌的关系,本实验通过RT-PCR方法检测不同卵巢组织里TIZ基因的表达情况、构建TIZ基因真核表达载体及RNA干扰等实验,研究TIZ与卵巢癌的关系及TIZ对卵巢癌细胞系生物学功能的影响。卵巢恶性肿瘤组织中TIZ mRNA的表达及其临床价值目的:探讨TIZ基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法:采用RT-PCR技术检测48例卵巢恶性肿瘤、22例卵巢良性肿瘤及24例正常卵巢组织TIZ mRNA的表达情况,分析TIZ基因与卵巢癌的关系。结果:(1)TIZ mRNA在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢恶性肿瘤组织中均有表达。TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较正常卵巢组织低(p＜0.05),TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较卵巢良性肿瘤组织低(p＜0.05);(2)TIZ基因表达与卵巢癌患者组织学类型,病理分级等临床病理特征及预后无关(p＞0.05)。结论:TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中表达降低。TIZ基因与抑癌基因作用相同,有抑制卵巢癌的发生的作用。TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出TIZ基因全长,构建其真核表达载体。为进一步研究TIZ与卵巢癌的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板,提取人卵巢癌组织总mRNA,利用PCR技术进行TIZ基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,将连接载体进行酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出TIZ基因全长,并经测序验证其同源性达99%,测序结果显示第1551位的T突变成C,但其编码氨基酸并不改变,属无意义突变,可以用于后续实验研究。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出TIZ基因全长并构建了其真核表达载体pcDNA3.1-TIZ。真核转染TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学行为影响的研究目的:了解TIZ基因对卵巢癌细胞生物学功能的影响,分析TIZ在卵巢癌发生发展过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建TIZ基因真核表达载体后,将其转染入无TIZ基因表达的卵巢癌细胞株HO8910,G418筛选后经RT-PCR鉴定,确认获得稳定转染的HO8910/pcDNA3.1-TIZ细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、克隆形成能力、细胞迁移能力、黏附能力、细胞侵袭能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达TIZ蛋白的卵巢癌细胞株。生长曲线显示转染了TIZ基因的卵巢癌细胞株生长速度减慢。流式细胞仪对细胞检测结果显示HO8910/pcDNA3.1-TIZ组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.6%,G1期为67.4%,对照组则相应为60.7%和39.3%,其处于增殖周期的细胞减少。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力侵、袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,TIZ能够抑制卵巢癌HO8910细胞的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。RNA干扰TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学功能影响的研究目的:通过构建人TIZ基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验。方法:针对TIZ mRNA的不同区域设计三组不同的siRNA片段,脂质体法转染TIZ高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时荧光定量PCR检验干扰效率,选择干扰效率最高的siRNA片段构建干扰载体。脂质体法转染TIZ基因高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3并进行G418抗性筛选,获得稳转细胞株,RT-PCR检验TIZ基因受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同siRNA干扰片段的干扰效果进行检测结果显示,TIZ-573组相对拷贝数为0.844±0.756,与其他两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。TIZ-573组抑制率最高,其抑制率为61%。构建干扰载体pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,转染卵巢癌细胞系SKOV3,获得稳定干扰表达株SKOV3/pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,RT-PCR检验其TIZ mRNA表达明显减少。生长曲线显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组比对照组的细胞生长快。流式细胞仪对细胞检测结果显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为65.1%,G1期为34.9%,对照组则相应为36.6%和63.4%,其处于增殖周期的细胞增加。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力、侵袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,干扰TIZ表达能够增强卵巢癌细胞SKOV3的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。

全文目录


致谢  7-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
英文缩写  15-17
第一章 卵巢癌相关的免疫学研究进展(文献综述)  17-81
  1 肿瘤相关抗原的概念  17
  2 肿瘤相关抗原的产生机制  17-22
    2.1 原癌基因被激活  18-19
    2.2 肿瘤抑制基因  19-21
    2.3 肿瘤相关抗原基因  21-22
  3 肿瘤相关抗原的分类及临床价值  22-25
    3.1 过表达抗原  22-24
    3.2 CT抗原  24-25
    3.3 分化抗原  25
  4 肿瘤相关抗原在肿瘤免疫中的作用  25-37
    4.1 肿瘤免疫的基本过程  25-28
    4.2 肿瘤抗原递呈细胞  28-31
    4.3 抗肿瘤的细胞免疫应答及对肿瘤细胞的杀伤作用  31-37
  5 肿瘤免疫逃逸  37-40
    5.1 概念  37
    5.2 肿瘤免疫逃逸的过程及可能机制  37-40
  6 卵巢癌的免疫  40-46
    6.1 卵巢癌患者机体细胞免疫状况  40-42
    6.2 卵巢癌免疫诊断概述  42-44
    6.3 卵巢癌免疫治疗概述  44-46
  7 卵巢癌相关抗原筛选鉴定及临床价值  46-68
    7.1 卵巢癌相关抗原筛选鉴定方法及优缺点  46-58
    7.2 卵巢癌相关抗原筛选鉴定现况  58-67
    7.3 已筛选鉴定并公认的卵巢癌相关抗原可能生物学功能列表  67-68
  8 TIZ与肿瘤的关系  68-79
    8.1 TIZ基因的结构、分布、作用  68-69
    8.2 TRAF-6分子的结构和分布及参与的信号传导  69-72
    8.3 核因子NF-κB  72-76
    8.4 丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导通路  76-79
  9 本实验的研究目的  79-81
第二章 TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其临床价值  81-100
  1.前言  81
  2.材料及方法  81-90
    2.1 材料  81-85
    2.2 实验方法及步骤  85-90
  3.结果  90-96
    3.1 卵巢肿瘤组织中TIZmRNA表达的PCR条件建立  90-91
    3.2 PCR产物的测序结果  91-92
    3.3 TIZ基因在不同卵巢组织中阳性表达率的比较  92-93
    3.4 卵巢恶性肿瘤组织TIZ mRNA表达与临床病理特征的关系  93-95
    3.5 卵巢恶性肿瘤组织TIZ mRNA阳性与阴性表达者生存时间的比较  95
    3.6 卵巢恶性肿瘤患者TIZ mRNA阳性表达与预后的关系  95-96
  4.讨论  96-100
    4.1 TIZ mRNA阳性表达与卵巢恶性肿瘤的关系  96-98
    4.2 TIZ mRNA阳性表达与卵巢恶性肿瘤的预后  98-100
第三章 TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建  100-118
  1.材料与方法  100-110
    1.1 材料  100-103
    1.2 引物设计与合成  103-104
    1.3 实验方法  104-110
  2.结果  110-115
    2.1 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测TIZ基因PCR产物结果  110
    2.2 PCR法鉴定质粒及双酶切法鉴定质粒结果  110-111
    2.3 TIZ全长测序结果及BLAST比对结果  111-115
  3.讨论  115-118
    3.1 TIZ基因的结构特点与测序结果分析  115-116
    3.2 pcDNA3.1载体选择的意义  116-117
    3.3 pcDNA3.1-TIZ真核表达载体的构建的意义  117-118
第四章 真核转染TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学行为影响的体外研究  118-139
  1.材料和方法  118-129
    1.1 材料  118-119
    1.2 主要试剂、配制及仪器  119-120
    1.3 实验方法  120-129
  2.结果  129-137
    2.1 不同种类卵巢癌细胞的TIZ基因表达情况  129-130
    2.2 转染条件的确定  130-131
    2.3 绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1阳性对照结果  131
    2.4 筛选HO-8910细胞的G418浓度的确定  131-132
    2.5 G418细胞筛选携带TIZ-pcDNA3.1载体的HO-8910细胞结果  132
    2.6 转染筛选出的HO-8910细胞RT-PCR检测TIZ表达结果  132-133
    2.7 获得稳定转染的三种HO8910细胞后得到的生长曲线  133-134
    2.8 筛选出的稳定转染的三种HO-8910检测细胞生长周期  134-135
    2.9 细胞集落形成实验结果  135
    2.10 细胞体外迁移能力的测定结果  135-136
    2.11 细胞体外侵袭能力测定结果  136
    2.12 细胞体外黏附能力测定  136-137
  3.讨论  137-139
第五章 RNA干扰TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学功能影响的体外研究  139-166
  1.材料和方法  139-148
    1.1 材料  139-143
    1.2 方法  143-148
  2.结果  148-162
    2.1 不同种类卵巢癌细胞的TIZ基因表达情况  148
    2.2 构建好的β-actin-pTG19-T质粒测序结果  148-149
    2.3 标准品QRT-PCR扩增标准曲线结果  149-150
    2.4 标准品测定的实时荧光扩增融解曲线结果  150-151
    2.5 siRNA转染SKOV3细胞48小时后在荧光显微镜下结果  151-153
    2.6 PCR检测不同TIZ siRNA干扰片段对SKOV3细胞抑制效果  153
    2.7 QRT-PCR检测转染不同siRNA后的SKOV3细胞TIZ基因表达情况  153-155
    2.8 将三种干扰片段构建入干扰载体pGPU6/GFP/Neo并测序  155-156
    2.9 筛选SKOV3细胞的G418浓度的确定  156-157
    2.10 稳定转染干扰载体的SKOV3细胞筛选  157
    2.11 RT-PCR检测载体干扰效果  157-158
    2.12 细胞生长曲线测定(MTT法)结果  158-159
    2.13 筛选出的稳定转染的两种SKOV3检测细胞生长周期  159-160
    2.14 胞体集落形成实验结果  160-161
    2.15 细胞体外迁移能力的测定结果  161
    2.16 细胞体外侵袭能力测定结果  161-162
    2.17 细胞体外黏附能力测定结果  162
  3.讨论  162-166
参考文献  166-195

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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