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玉米大斑病菌黑色素合成酶基因StPKS的克隆和功能分析

作　者: 刘士伟
导　师: 董金皋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 玉米大斑病菌黑色素聚合酮合成酶基因(PKS) 功能研究
分类号: S435.131
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

为了明确玉米大斑病菌黑色素的合成与病菌致病性的关系,本文对玉米大斑病菌黑色素生物合成相关基因StPKS进行了克隆、生物信息学分析和功能研究,初步明确了StPKS在玉米大斑病菌黑色素合成途径中的作用及其与致病性的关系。根据已知植物病原真菌黑色素生物合成过程中的多聚酮合成酶基因PKS(polyketide synthase)的DNA保守序列设计引物,利用Genome Walking技术获得了StPKS的DNA序列及其侧翼序列,分别以玉米大斑病菌基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR技术获得StPKS基因的全长序列。对DNA序列和cDNA序列进行对比分析,发现StPKS基因序列全长6527 bp,含有一个50 bp的内含子,具有完整的开放阅读框架,编码2158个氨基酸残基,蛋白的分子量约为232.6663 kD,等电点pI6.00;含有955个疏水性氨基酸残基和1203个亲水性氨基酸残基;包含完整的酮酰合成酶(KT)、酰基载体转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)结合位点、硫酯酶(TE)等保守结构域。生物信息学分析表明,其氨基酸序列与水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)、玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、小麦褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的PKS基因序列同源性分别为91%、89%、84%、79%。制备基因特异探针进行Southern杂交分析,发现StPKS基因在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。利用Genome Walking技术获得了StPKS基因5′端277 bp、3′端664 bp的非编码区,使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析,发现由起始密码子至上游约170 bp左右范围内有很强的启动子结构,其中在?17 bp处发现了1个TATA box等。构建了StPKS基因的双交换基因敲除载体,利用PEG4000介导法转化玉米大斑病菌的原生质体,经潮霉素筛选3代,共获得了50个阳性转化子,其中有4个菌株呈现灰白色菌落,经PCR验证有清晰的潮霉素扩增条带,然后分别对其进行Southern杂交分析,获得突变菌株。表型分析结果表明,突变体菌丝呈白色或灰白色,致病性丧失,证实StPKS基因与黑色素合成途径相关。本试验从基因克隆和基因缺失突变体分析进行了研究,为进一步明确玉米大斑病菌的致病机理,及在基因水平上研究黑色素途径对玉米大斑病菌致病性的关键作用提供理论依据,为新型杀真菌制剂的研制奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-11
2 材料和方法  11-24
  2.1 试验材料  11-13
    2.1.1 菌株、质粒和玉米品种  11
    2.1.2 主要试剂  11
    2.1.3 供试培养基及试剂配制  11-12
    2.1.4 主要仪器  12
    2.1.5 引物序列  12-13
  2.2 基因组DNA 及总RNA 的获得  13-15
    2.2.1 玉米大斑病菌基因组DNA 的提取  13-14
    2.2.2 玉米大斑病菌总RNA 提取  14
    2.2.3 反转录体系及第一链cDNA 的合成  14-15
  2.3 玉米大斑病菌STPKS 基因的克隆  15-19
    2.3.1 模板DNA 的制备和引物的设计  15
    2.3.2 Genome walking PCR 扩增  15-16
    2.3.3 基因的拼接  16
    2.3.4 StPKS 基因DNA 和cDNA 全长的获得  16
    2.3.5 DNA 片段的纯化  16-17
    2.3.6 PCR 产物与pMD18-T 载体的连接  17
    2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  17
    2.3.8 连接产物转化感受态细胞  17-18
    2.3.9 PCR 验证阳性克隆  18
    2.3.10 碱裂解法小量提取质粒  18
    2.3.11 质粒样本测序分析  18-19
  2.4 基因的拷贝数分析  19-20
    2.4.1 探针制备  19
    2.4.2 酶切  19
    2.4.3 转膜  19
    2.4.4 杂交  19-20
    2.4.5 免疫检测  20
  2.5 STPKS 基因的功能分析  20
    2.5.1 生物信息学方法分析、预测StPKS 基因的结构和功能  20
    2.5.2 玉米大斑病菌对潮霉素敏感性实验  20
  2.6 STPKS 基因的同源重组  20-24
    2.6.1 StPKS 同源重组载体的构建  20-22
    2.6.2 StPKS 同源重组载体转化玉米大斑病菌原生质体  22-23
    2.6.3 转化子验证及分析  23-24
3 结果与分析  24-47
  3.1 基因组DNA 的提取  24
  3.2 STPKS 基因的获得  24-27
    3.2.1 StPKS 基因上游片段的获得  24
    3.2.2 基因全序列的获得  24-27
  3.3 玉米大斑病菌StPKS 基因全长DNA 和cDNA 扩增  27-28
  3.4 StPKS 基因生物信息学分析  28-39
    3.4.1 产物的纯化、克隆、测序和生物信息学分析  28-30
    3.4.2 StPKS 基因的结构分析  30-37
    3.4.3 StPKS 基因启动子区分析  37
    3.4.4 StPKS 基因的信号肽预测  37-38
    3.4.5 StPKS 基因跨膜结构域的预测  38-39
    3.4.6 StPKS 的三级结构分析  39
  3.5 STPKS 基因拷贝数分析  39-41
    3.5.1 StPKS 基因探针的制备  39-40
    3.5.2 Southern 杂交  40
    3.5.3 玉米大斑病菌对潮霉素敏感性试验  40-41
  3.6 STPKS 的同源重组  41-47
    3.6.1 StPKS 基因同源重组载体构建  41-43
    3.6.2 StPKS 基因同源重组载体转化  43-44
    3.6.3 StPKS 基因同源重组转化子筛选  44
    3.6.4 Southern 杂交鉴定  44-45
    3.6.5 突变体性状观察  45-46
    3.6.6 突变体显微观察  46
    3.6.7 突变体致病力检测  46-47
4 讨论  47-49
  4.1 获得基因侧翼序列的技术  47
  4.2 STPKS 的结构域及功能预测  47-48
  4.3 STPKS 基因功能的研究  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-55
在读期间发表的学术论文  55-56
作者简历  56-57
致谢  57

玉米大斑病菌黑色素合成酶基因StPKS的克隆和功能分析

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