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玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因相关线性质粒的研究

作　者: 孙伟明
导　师: 郭巍；刘大群
学　校: 河北农业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 线性质粒抗生素非核糖体多肽合成酶聚酮合成酶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 78次
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内容摘要

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一株从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离的生防菌,能够产生多种脂溶性抗生素,对多种植物病原菌有抑制作用。根据“链霉菌线性质粒5’末端都结合有共价蛋白”这一性质,通过改进琼脂糖包埋块制作方法,发明了一项高效快速检测链霉菌质粒种类和构型的技术,即“包埋块二次处理法”,并检测出了Men-myco-93-63中存在两种内源线性质粒。双向电泳验证了该方法的正确性,推测质粒大小分别约为47 kb和53 kb。利用冻融法、SDS/高温循环法和原生质体法对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63内源线性质粒进行消除,来检测抗生素合成相关基因是否位于质粒DNA上。结果表明,冻融法和SDS/高温循环法分别能有效地获取稳定的缺失质粒pSR47而保留pSR53的菌株P1、P2、P3、P4、P6、P7以及SH7、SH9,它们不能正常产生孢子,对棉花黄萎病菌V41的抑制作用消失,而对马铃薯疮痂病菌H2的抑制作用不变或减弱。因此推测线性质粒pSR47可能含有抑制棉花黄萎病菌V41的抗生素合成相关基因和控制孢子形成的基因,而抑制马铃薯疮痂病菌H2的抗生素合成相关基因定位在染色体或pSR53上。线性质粒pSR53很难消除,推测pSR53可能含有宿主菌的持家基因。SDS/高温循环质粒消除法获得的异形菌株SH10,开始在PDA培养基上呈“光秃”型,产生黄色可溶色素,生物活性无变化,但在传代培养过程中形态特征又恢复到野生型,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63染色体DNA或pSR53含有类似于灰色链霉菌的形态分化adsA的基因,并受某种因子调控。利用“高盐浓度下CTAB能使大部分糖类和脂类沉淀”的原理,改进了提取基因组DNA的CTAB法,得到了符合构建cosmid基因组文库的大于150kb的基因组DNA,片段大小均一。利用“水煮后5’末端结合有共价蛋白的线性质粒能跟蛋白质一起沉淀,而与染色体DNA分开”的假设来分离线性质粒,成功地提取了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的两种线性质粒,但产量较低,尚需进一步优化。通过克隆pSR47的端粒及构建pSR47基因文库,获得了pSR47的DNA序列,目前拼接得到66个contigs,共131 428bp。核苷酸序列比对发现,pSR47的一部分序列与先前得到的抗生素合成相关基因克隆子pSA31、pSA321和pSA32一致,表明pSR47与抗生素合成相关。生物信息学分析发现pSR47含有抗生素合成关键酶NRPSs/PKSs杂合基因,形态分化调控基因ssgA,whiB-like和FtsK/SpoIIIE家族基因,细胞色素P450基因,细胞色素代谢相关的基因,羊毛硫抗生素修饰蛋白LanC基因,一个组氨酸激酶信号传导途径的操纵子及一些转录调控基因和质粒自身复制、修复、整合及接合转移的基因。这些基因控制的性状与pSR47质粒缺失菌株性状吻合,这直接证明pSR47与抗生素合成相关。但线性质粒的异源转化没有获得成功,有待进一步摸索转化条件。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
引言  11-15
  1 玫瑰黄链霉菌研究进展  11-12
  2 抗生素生物合成基因簇的组成特点及克隆策略  12-13
  3 链霉菌线性质粒的研究进展  13
  4 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 的研究进展及立题依据和目的意义  13-15
第一章内源线性质粒的检测分析  15-22
  1 材料和方法  15-18
    1.1 材料  15-16
    1.2 菌丝体培养  16
    1.3 基因组DNA 的提取  16
    1.4 碱性溶菌法提取内源质粒  16
    1.5 改进的碱裂解法提取内源质粒  16-17
    1.6 标准琼脂糖包埋块的制备  17
    1.7 非标准琼脂糖包埋块的制备  17
    1.8 二次处理  17
    1.9 电泳检测质粒构型  17-18
    1.10 双向电泳验证  18
    1.11 脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测质粒种类  18
    1.12 电泳验证质粒大小  18
  2 结果与分析  18-20
    2.1 基因组DNA 及内源质粒DNA 的检测  18-19
    2.2 “包埋块二次处理法”检测质粒构型  19
    2.3 双向电泳验证  19
    2.4 PFGE 检测质粒种类及大小  19-20
    2.5 验证线性质粒大小  20
  3 讨论  20-21
  4 结论  21-22
第二章质粒消除  22-35
  1 材料和方法  22-27
    1.1 材料  22-23
    1.2 冻融法去除质粒  23
    1.3 十二烷基硫酸钠（SDS）/高温循环法去除质粒  23-24
    1.4 原生质体法去除质粒  24
    1.5 传代培养  24
    1.6 包埋块法验证  24-25
    1.7 16s rDNA 扩增  25
    1.8 形态观察  25-26
    1.9 链霉菌菌种保存  26
    1.10 生物活性测定  26
    1.11 粗提抗生素的制备  26
    1.12 粗提抗生素的活性测定  26-27
    1.13 薄层层析分析  27
  2 结果与分析  27-32
    2.1 冻融质粒消除法  27
    2.2 SDS/高温循环质粒消除法  27-28
    2.3 原生质体质粒消除法  28
    2.4 传代培养  28-29
    2.5 16s rDNA 序列分析  29
    2.6 包埋块验证  29-30
    2.7 形态特征  30-31
    2.8 生物活性测定  31
    2.9 粗提抗生素的生物活性测定  31-32
    2.10 薄层层析分析  32
  3 讨论  32-34
  4 结论  34-35
第三章线性质粒DNA 及大片段基因组DNA 提取方法的研究  35-42
  1 材料和方法  35-39
    1.1 材料  35
    1.2 菌丝体的培养及检测  35
    1.3 活性成分的检测  35-36
    1.4 基因组DNA 提取方法的摸索  36-38
    1.5 线性质粒提取方法的探索  38
    1.6 脉冲场凝胶电泳  38-39
    1.7 紫外检测浓度和纯度  39
    1.8 琼脂糖凝胶电泳  39
  2 结果与分析  39-41
    2.1 菌株质量检测  39
    2.2 基因组DNA 的检测  39-40
    2.3 基因组DNA 的质量分析  40
    2.4 线性质粒DNA 的检测  40-41
  3 讨论  41
  4 结论  41-42
第四章内源线性质粒的分子生物学研究  42-58
  1 材料与方法  42-44
    1.1 材料  42
    1.2 线性质粒的分离  42
    1.3 端粒的克隆  42-43
    1.4 线性质粒DNA 文库的构建  43-44
    1.5 线性质粒的异源转化  44
  2 结果与分析  44-54
    2.1 检测分离的线性质粒  44
    2.2 线性质粒的部分酶切  44-45
    2.3 检测文库质量  45
    2.4 序列分析  45-54
    2.5 线性质粒的异源转化  54
  3 讨论  54-57
    3.1 非核糖体合成酶（NRPSs）  54-55
    3.2 聚酮合成酶（PKSs）  55
    3.3 次级代谢调控基因  55-56
    3.4 其他抗生素相关基因  56-57
    3.5 形态分化基因  57
  4 结论  57-58
全文结论  58-59
参考文献  59-67
附录  67-68
作者简历  68-69
致谢  69

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因相关线性质粒的研究

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