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原核表达的rADTZ复性及性质研究

作　者: 沈奕
导　师: 刘大岭；姚冬生
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄曲霉毒素解毒酶 MBP_ADTZ融合蛋白复性圆二色性分性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是一种具有强致癌性、致畸性和遗传毒性的物质,本研究所已经分离出一种产黄曲霉素解毒酶（ADTZ）的真菌E20,并对其进行基因克隆和重组表达,得到了重组黄曲霉毒素解毒酶（rADTZ）。rADTZ为一新发现的氧化酶,其一级序列与已知蛋白具有较低的同源性,对该酶的研究具有重要的理论和实践意义。实验室前期的工作成功将黄曲霉毒素解毒酶基因克隆到含有融合标签MBP的pMAL—C2X载体并在大肠杆菌中进行重组诱导表达,表达效率较高,但活性不理想。本研究将原核表达的rADTZ经尿素变性,然后尝试不同的复性条件,以期望获得高纯的、高活性的rADTZ蛋白,为进一步对rADTZ结构及功能的深入研究奠定基础。方法:采用亲和层析纯化融合蛋白MBP rADTZ,Factor Xa酶切融合蛋白MBP_rADTZ,制备高纯的MBP及rADTZ蛋白混合液,经尿素变性后,以各种复性缓冲液进行复性。探讨的复性条件包括:酸碱性、氧化还原性、糖类、氨基酸、无机盐、表面活性剂等,利用辣根过氧化物酶（HRP）测活系统筛选出有活性的样品组。分子筛Superose^TM12 10/300 GL分子筛层析方法对复性后的酶蛋白进行了纯化,并测量其表观分子量,圆二色光谱法测量rADTZ的二级结构,等温滴定微量热法（ITC）对可能与rADTZ结合的金属离子进行确认,并对其可能的作用机制做了探讨。结果与结论:经过复性条件的筛选,确定了较优的复性方法:复性样品蛋白含量为7.3μg/组,复性温度为4℃,基础复性缓冲液的组成为0.02M Na₂HPO₄-0.01M柠檬酸（pH5.8）,可加入的[GSH]/[GSSG]及添加剂有以下两种:①变性过程中不加入EDTA时,复性时[GSH]/[GSSG]=1:1,复性剂为0.1M NaCl+10%甘油+Arg/Glu（50mM/10mM）+0.05MPro,在第1-3天时均可测到活性;②变性过程中加入EDTA时,复性时[GSH]/[GSSG]=3:1,复性剂为Arg/Glu（50mM/10mM）+0.05mM Zn2+,分别在第2、3天测到活性;复性结果rADTZ对AFB1转化率分别为63%和39.6%,酶活分别为135U/mL和85U/mL。可能的作用机制是:复性过程中氯化钠的加入使rADTZ的可溶性增加,减少了复性时聚集体产生的几率;而氨基酸的加入不仅抑制了热变性过程中蛋白质的聚集,而且可以诱发伸展肽链产生α—螺旋和正确的三级结构。分子筛Superose^TM12 10/300 GL层析方法对复性后的酶蛋白进行了纯化,得到了一条电泳纯大于95%的条带,并测量了rADTZ的表观分子量,约为76KD,表明有活性的rADTZ为一单体;圆二色光谱法测量其二级结构,结果为α—螺旋为39.4%、β-折叠为10.2%、β—转角为13.7%和无规则卷曲为36.7%,测定结果与生物信息学预测的结果基本一致;等温滴定微量热法（ITC）提示rADTZ与Zn²⁺有结合作用,证实了生物信息学中关于ADTZ有可能存在一个锌指结构的推测,同时锌指结构提示ADTZ有可能存在一个水解功能区。综合本实验结果以及前期的研究工作,可以推测ADTZ可能是一个氧化-水解的双功能酶,一级序列中的两个半胱氨酸不形成分子内或分子间的二硫键,第502位半胱氨酸位于锌指结构域中,参与Zn²⁺的结合。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第一章前言  11-30
  1.1 黄曲霉毒素的简介  11
  1.2 黄曲霉毒素的结构及其理化特性  11-12
  1.3 黄曲霉毒素的生物合成  12-13
  1.4 黄曲霉毒素的危害  13-14
  1.5 黄曲霉毒素去毒化的研究进展  14-17
    1.5.1 物理化学去毒  14-15
    1.5.2 生物学去毒  15-17
  1.6 蛋白质的体外复性  17-26
    1.6.1 蛋白质的折叠机理  17-18
    1.6.2 复性的基本原则  18
    1.6.3 复性的方法  18-21
      1.6.3.1 稀释复性  19
      1.6.3.2 膜控制的变性剂除去过程  19
      1.6.3.3 色谱复性技术  19-21
    1.6.4 影响复性效率的环境因素  21-25
    1.6.5 复性结果的检测方法  25-26
  1.7 圆二色谱在结构生物学研究中的应用  26-27
  1.8 等温滴定微量热法  27-28
  1.9 研究背景、目的与意义  28-30
第二章实验设备及材料  30-34
  2.1 主要仪器设备  30
  2.2 试剂  30-34
    2.2.1 常用试剂  30-31
    2.2.2 培养基&其他试剂  31-34
第三章实验方法  34-46
  3.1 MBP_ADTZ融合蛋白的诱导表达  34-37
  3.2 MBP_ADTZ融合蛋白的亲和层析  37-38
    3.2.1 MBP_ADTZ融合蛋白的亲和层析  37
    3.2.2 MBP_ADTZ融合蛋白的亲和层析pH的优化  37-38
  3.3 酶切MBP_ADTZ融合蛋白,释放rADTZ  38-39
  3.4 复性  39-43
    3.4.1 待复性rADTZ的变性  39
    3.4.2 复性体系的设计  39-40
    3.4.3 复性  40-41
    3.4.4 复性条件的优化  41-42
    3.4.5 氧化还原条件对复性的影响  42
    3.4.6 复性后rADTZ活性的测定  42-43
  3.5 复性产物的分离纯化  43-44
    3.5.1 复性产物的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析  43-44
    3.5.2 复性产物的Superose~(TM) 12 10/300 GL分子筛层析  44
  3.6 复性后rADTZ二级结构的圆二色性分析  44-45
  3.7 复性后rADTZ分子间二硫键的分析  45
  3.8 rADTZ活性中心金属离子结合的分析  45-46
第四章实验结果  46-69
  4.1 高表达量的重组菌的筛选结果  46-47
  4.2 MBP_ADTZ融合蛋白的可溶性分析  47
  4.3 重组菌的发酵培养  47-48
  4.4 亲和层析  48-50
    4.4.1 pH的摸索  48-49
    4.4.2 亲和层析  49-50
  4.5 酶切MBP_rADTZ融合蛋白释放rADTZ  50-51
  4.6 复性  51-61
    4.6.1 各种促折叠物质对复性的影响  51-58
    4.6.2 复性条件的优化  58-60
    4.6.3 氧化还原条件对复性的影响  60-61
    4.6.4 复性小结  61
  4.7 复性产物的分离纯化  61-64
    4.7.1 复性产物的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析  61-62
    4.7.2 复性产物的Superose~(TM) 12 10/300 GL分子筛层析  62-64
  4.8 复性后rADTZ二级结构的圆二色性分析  64-65
  4.9 复性后rADT分子间二硫键的分析  65-67
  4.10 rADTZ活性中心与金属离子的分析  67-69
    4.10.1 rADTZ与锌离子的分析  67
    4.10.2 rADTZ与铜离子的分析  67-69
第五章讨论与分析  69-78
  5.1 亲和层析纯化优化  69
  5.2 复性条件的筛选  69-74
    5.2.1 变性剂  69
    5.2.2 变性剂的去除  69-70
    5.2.3 复性环境  70-72
    5.2.4 EDTA与金属离子  72
    5.2.5 氧化还原环境  72-74
  5.3 rADTZ活性检测  74
  5.4 rADTZ蛋白的分离纯化  74-75
  5.5 rADTZ蛋白二级结构的圆二色性分析  75
  5.6 分子间二硫键的分析  75-76
  5.7 rADTZ金属离子结合性及结构的分析  76-77
  5.8 关于ADTZ活性中心的讨论  77-78
第六章小结与展望  78-80
致谢  80-81
参考文献  81-94
攻读硕士学位期间发表论文  94-95
致谢  95

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