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MMP9-PEX原核表达、纯化与复性研究

作　者: 张伟静
导　师: 李锦毅
学　校: 辽宁医学院
专　业: 内科学
关键词: 血红素蛋白样结构域原核表达包涵体纯化复性
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的PEX是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)C端的血红素样结构域(hemopexin domain),它主要通过抑制MMPs的活性来抑制血管发生、细胞增殖和侵袭。本实验通过构建MMP9-PEX原核表达质粒,对人基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase, MMP9)C末端血红素结合蛋白样结构域的原核表达、透析复性条件进行优化,以获得高表达的活性蛋白。方法①Trizol裂解法自人肝组织中提取总RNA, RT-PCR法扩增MMP9-PEX基因片段;②利用基因重组技术将MMP9-PEX基因片段插入PET-his质粒,构建原核表达质粒;③将构建好的原核表达质粒PET-his-MMP9-PEX转化大肠埃希菌菌株BL21(DE3),异丙基β-D硫代半乳糖苷( IPTG)诱导后产生包涵体蛋白,探讨不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同菌液密度值对目的蛋白表达产量的影响;④盐酸胍裂解包涵体,用镍琼脂糖凝胶纯化重组蛋白,蛋白印迹(western blot)方法检测MMP-9-PEX表达;⑤对纯化蛋白的透析复性条件进行优化,明胶酶谱方法检测MMP9-PEX活性。结果酶切和基因测序结果表明,成功构建了重组质粒PET-his-MMP9-PEX;重组质粒转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导发现30kDa处蛋白质条带明显增强;包涵体蛋白经洗涤、裂解、纯化后纯度在95%以上,蛋白经复性条件优化后回收率为36.86%;明胶酶谱方法检测表明,胶酶降解作用由于加入MMP-9-PEX而减弱,说明复性得到的蛋白具有生物学活性。结论成功构建了重组质粒PET-his-MMP9-PEX,优化了MMP9-PEX原核表达、透析复性条件,获得了有活性的MMP9-PEX蛋白,为进一步研究MMP9-PEX的功能提供了实验基础。

全文目录

摘要  4-8
  中文论著摘要  4-6
  英文论著摘要  6-8
英文缩略语  8-9
前言  9-10
实验材料与方法  10-22
实验结果  22-26
讨论  26-29
结论  29-30
本研究创新性的自我评价  30-31
参考文献  31-34
附录  34-44
  综述  34-42
  在学期间科研成绩  42-43
  致谢  43-44
  个人简介  44

MMP9-PEX原核表达、纯化与复性研究

内容摘要

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