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丙型肝炎病毒NS2TP基因调节机制的研究

作　者: 杨彪
导　师: 黄敏
学　校: 大连医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: HCV NS2 NS2TP基因启动子环磷酸腺苷反应结合元件
分类号: R512.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:NS2TP基因是抑制性消减杂交技术(SSH)筛选出的HCV NS2反式激活的基因之一。本实验中,我们对HCV NS2反式激活NS2TP基因从翻译水平和转录水平进行验证,进而定位NS2TP基因启动子的核心区域,并初步探究了NS2TP基因的转录调节机制。方法:(1) HCV NS2对NS2TP基因反式激活作用的验证。首先,运用pcDNA3.1(–)-NS2表达载体转染HepG2细胞,以pcDNA3.1(–)为阴性对照组。提取总蛋白、总RNA,然后分别从翻译水平,即Western Blot实验,和转录水平,即进行Real-time PCR实验。分析和研究NS2对NS2TP基因的反式激活作用。(2) NS2TP基因启动子的活性分析与核心区的确定。首先,成功构建pGL4.10-NS2TP启动子双荧光素酶报告基因表达载体系统,运用构建的不同截短型载体转染HepG2细胞,在对启动子活性进行分析的基础上,实验确定了NS2TP基因启动子活性的核心区域,同时也分析了NS2对NS2TP基因启动子的调节作用。(3) NS2TP基因转录调节因子CREB作用启动子核心区的验证。运用生物信息学技术分析了启动子的核心区,识别CREB因子结合位点,并通过EMSA、ChIP、CREB位点突变、过表达CREB蛋白和特异性抑制CREB实验,研究转录调节因子CREB是否参与了NS2TP基因的转录调节。结果:(1) Real-time PCR实验证实,HCV NS2上调NS2TP基因的转录水平,Western Blot实验,证实HCV NS2促进NS2TP的表达。(2) NS2TP基因最小的启动子活性区域位于转录起始位点上游257个核苷酸(–257-bp至+93-bp)内,同时我们也验证了NS2上调NS2TP基因启动子的活性。(3)通过EMSA和ChIP,证实CREB为NS2TP基因主要转录因子调节蛋白。CREB位点突变、过表达CREB和特异性抑制CREB实验,证实CREB参与了NS2TP基因的调节。结论:(1) HCV NS2能够反式激活NS2TP基因。(2) NS2TP基因启动子的核心区位于–257-bp至+93-bp。(3) CREB转录调节因子参与NS2TP基因的转录调控。

全文目录

中文摘要 7-9英文摘要 9-111 前言 11-132 NS2 反式激活 NS2TP 基因的研究 13-44 2.1 引言 13 2.2 蛋白质水平的研究 13-18 2.2.1 引言 13 2.2.2 材料与方法 13-17 2.2.3 结果 17-18 2.2.4 讨论 18 2.3 mRNA 水平的研究 18-25 2.3.1 引言 18 2.3.2 材料与方法 18-23 2.3.3 结果 23-24 2.3.4 讨论 24-25 2.4 启动子活性的确定 25-40 2.4.1 引言 25 2.4.2 材料与方法 25-33 2.4.3 结果 33-40 2.4.4 讨论 40 2.5 启动子水平的研究 40-43 2.5.1 引言 40 2.5.2 材料与方法 40-42 2.5.3 结果 42-43 2.5.4 讨论 43 2.6 本章小结 43-443 CREB 因子对 NS2TP 基因转录水平的调节研究 44-59 3.1 引言 44 3.2 EMSA 验证 CREB 蛋白结合于 NS2TP 基因启动子 44-49 3.2.1 引言 44 3.2.2 材料与方法 44-48 3.2.3 结果 48 3.2.4 讨论 48-49 3.3 ChIP 验证 CREB 蛋白结合于 NS2TP 基因启动子 49-52 3.3.1 引言 49 3.3.2 材料与方法 49-52 3.3.3 结果 52 3.3.4 讨论 52 3.4 验证CREB 蛋白调节NS2TP 基因转录活性 52-57 3.4.1 引言 52 3.4.2 材料与方法 52-55 3.4.3 结果 55-57 3.4.4 讨论 57 3.5 本章小结 57-594 结论和展望 59-61参考文献 61-64综述 64-79 综述正文 64-72 参考文献 72-79附录 79-83英文缩略语表 83-84致谢 84

丙型肝炎病毒NS2TP基因调节机制的研究

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