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毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子在南极假丝酵母脂肪酶B表达上的应用

作　者: 袁围
导　师: 林影
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 毕赤酵母 翻译延伸因子1-α 南极假丝酵母脂肪酶B 分泌表达 启动子
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


巴斯德毕赤酵母表达系统经过近三十年的发展,已成为可以生产多种外源蛋白的高效表达系统之一。毕赤酵母表达系统中,应用最广泛的启动子为乙醇氧化酶Ⅰ基因启动子(PAOX1),由于该启动子需要甲醇诱导,从而限制了所表达的外源蛋白在食品,医药等行业上的应用。此外,在利用PAOX1控制外源蛋白表达的系统中,发酵过程一般分为二个阶段:甘油补料期和甲醇诱导期。由于甘油补料期甘油的存在阻遏了PAOX1,从而使得该阶段的外源蛋白表达量极其低。因此在工业上增加南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的表达量也成为必要。本研究利用毕赤酵母中组成型启动子—翻译延伸因子1-α启动子(PTEF1),在以甘油为碳源的培养基中对表达CALB进行了初步的探索。同时,为了满足工业上的需要,采用PTEF1和PAOX1联合控制CALB表达系统,对增加CALB在甘油补料期的表达量进行了初步的探索,具体结果如下:1.从本实验室保藏的质粒pICAS-CALB中克隆出CALB,构建分泌表达载体pAOX9K-CALB。从毕赤酵母基因组GS115中克隆PTEF1,以PTEF1替换毕赤酵母表达载体pAOX9K-CALB中的PAOX1,得到重组质粒pTEF9K-CALB,转化毕赤酵母GS115后在组氨酸营养缺陷型MD平板上获得重组酵母GS115/pTEF9K-CALB。并通过与用相同方法构建的重组菌GS115/pGAP9K-CALB相比,发现PTEF1更适合于应用于表达CALB。摇瓶培养下,重组菌GS115/pTEF9K-CALB发酵72小时后发酵液中酶活,达到32U/mL;通过50L发酵罐碳源流加补料,重组菌GS115/pTEF9K-CALB发酵79h后发酵液中酶活,最高达到285U/mL,这说明PTEF1是一个高强度的组成型启动子,利用该启动子可以扩大外源蛋白在食品,医药等行业上的应用。2.构建了重组载体pPICZαA-CALB,转入重组毕赤酵母pTEF9K-CALB,在含博莱霉素（zeocin）的平板上获得由组成型启动子和诱导型的启动子(PAOX1,PTEF1)控制CALB表达的重组酵母菌（GTA）。摇瓶培养下,重组菌GTA发酵72小时后发酵液中酶活,达到46.5U/mL。通过50L发酵罐碳源流加补料,重组菌GTA诱导96h后发酵液中酶活,最高达到560U/mL,比在相同培养条件下重组菌GS115/pAOX9K-CALB（GA）发酵液中的酶活,要高50%左右,这说明采用双启动子(PAOX1,PTEF1)控制系统,为将来提高其它外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了一个模型。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
英文缩略词表  10-11
第一章 绪论  11-20
  1.1 毕赤酵母表达外源蛋白及其进展  11-13
    1.1.1 毕赤酵母生物学特性  11
    1.1.2 毕赤酵母遗传学特征  11
    1.1.3 毕赤酵母表达系统的优点  11-12
    1.1.4 毕赤酵母表达外源蛋白  12-13
  1.2 毕赤酵母中的启动子的研究进展  13-14
    1.2.1 毕赤酵母中的启动子的简介  13-14
    1.2.2 毕赤酵母中碳源的研究进展  14
  1.3 脂肪酶的研究进展  14-18
    1.3.1 脂肪酶的简介  14-15
    1.3.2 脂肪酶的结构  15-16
    1.3.3 脂肪酶的理化性质  16
    1.3.4 脂肪酶的应用  16-17
    1.3.5 南极假丝酵母脂肪酶B的研究进展  17-18
  1.4 本课题研究的意义及主要内容  18-20
    1.4.1 本课题研究的意义  18-19
    1.4.2 本课题研究的内容  19-20
第二章 利用PTEF1在毕赤酵母中表达CALB  20-50
  2.1 引言  20
  2.2 实验材料与设备  20-24
    2.2.1 主要仪器和设备  20-21
    2.2.2 质粒与菌株  21
    2.2.3 主要试剂  21-22
    2.2.4 溶液与培养基  22-24
  2.3 技术路线  24
  2.4 实验方法  24-38
    2.4.1 菌体的培养  24-25
    2.4.2 菌种的保存  25
    2.4.3 酵母基因组的提取  25
    2.4.4 毕赤酵母分泌表达载体构建  25-33
    2.4.5 重组质粒线性化  33
    2.4.6 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化  33-34
    2.4.7 毕赤酵母重组子筛选  34
    2.4.8 各重组毕赤酵母的摇瓶分批补料发酵  34
    2.4.9 重组菌 GS115/pTEF9K-CALB 在 50L 发酵罐中流加补料发酵  34
    2.4.10 重组菌 GS115/pAOX9K-CALB 在 50L 发酵罐中流加补料发酵  34-35
    2.4.11 CALB酶活测定  35
    2.4.12 培养基中甘油浓度的测定  35-36
    2.4.13 蛋白质SDS电泳分析  36-38
  2.5 实验结果与讨论  38-48
    2.5.1 CALB分泌表达载体的构建流程  38-42
    2.5.2 重组质粒转化及筛选  42
    2.5.3 甘油浓度对重组菌 GS115/pTEF9K-CALB 表达 CALB 的影响  42-44
    2.5.4 P_(TEF1)与P_(GAP)，P_(AOX1)在表达CALB上的比较  44-45
    2.5.5 重组菌GS115/pTEF9K-CALB在50L发酵罐中流加补料发酵  45-48
  2.6 小结  48-50
第三章 联合使用P_(TEF1)和P_(AOX1)在毕赤酵母中共表达CALB  50-58
  3.1 引言  50
  3.2 实验材料与设备  50-51
    3.2.1 菌株与质粒  50-51
    3.2.2 分子克隆用酶和试剂  51
    3.2.3 化学试剂  51
    3.2.4 实验仪器设备  51
    3.2.5 溶液与培养基  51
  3.3 实验方法  51-53
    3.3.1 CALB的PCR扩增  51
    3.3.2 DNA凝胶回收  51
    3.3.3 限制性内切酶酶切  51-52
    3.3.4 酶切产物回收  52
    3.3.5 DNA片段的连接反应  52
    3.3.6 大肠杆菌感转化  52
    3.3.7 大肠杆菌重组的提取  52-53
    3.3.8 重组质粒pPICZαA-CALB的双酶切鉴定  53
    3.3.9 酵母感受态细胞的制备及酵母转化  53
    3.3.10 重组毕赤酵母转化子的筛选及在毕赤酵母中的表达  53
    3.3.11 蛋白质电泳分析  53
  3.4 结果和讨论  53-57
    3.4.1 载体pPICZαA-CALB的构建  53-54
    3.4.2 毕赤酵母转化和重组子的筛选  54-55
    3.4.3 重组菌GAT与GA产酶比较  55
    3.4.4 重组菌GAT与GA的蛋白电泳分析  55-56
    3.4.5 重组菌GAT，GA 在50L发酵罐中流加补料发酵  56-57
  3.5 本章小结  57-58
结论与展望  58-60
  结论  58
  本论文的创新之处  58-59
  展望  59-60
参考文献  60-65
攻读硕士学位期间取得的研究成果  65-66
致谢  66-67
答辩委员会对论文的评定意见  67

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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