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Bcl-2编码区基因多态性与男性生精障碍的相关性及机制研究

作　者: 马骏
导　师: 王守林；李忠；刘起展
学　校: 南京医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 原发性无精子症原发性少精子症精子生成障碍单核苷酸多态性 Bcl-2基因 Bcl-2 自然变异体细胞转染细胞毒性凋亡凋亡相关蛋白
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

世界卫生组织(WHO)的统计数据表明,全世界约有8-15%的育龄夫妇被不孕不育所困扰。在所有的不孕不育中,由男方因素造成的约占50%,其中一个重要的原因是精子生成障碍,约占男性不育的10%,主要表现为无精子症或少精子症。产生成熟的精子是男性具有生育能力的首要条件,许多与生精相关的基因参与了精子发生这一复杂过程。近年来的研究发现,如果精子生成过程中的调控基因出现缺失、突变或表达异常都有可能引起精子生成障碍,形成少精子症或无精子症,导致男性不育症。由遗传缺陷包括单基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍估计占男性不育的30%。其中基因多态性尤其是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)是人类最常见的遗传变异,它可以引起基因产物或功能的改变。越来越多的研究表明,精子生成障碍与某些特定基因的多态性存在相关性。在哺乳动物的正常精子生成过程中,生精细胞的退化死亡是一个重要的环节。据估计,约占潜在成熟精子数量25-75%的生殖细胞将会在精子生成过程中退化,而现在普遍认为这些生殖细胞的自发性死亡主要是通过凋亡实现的,因此生殖细胞凋亡是精子发生和成熟过程中关键的环节。体内许多调节凋亡的因素参与了精子细胞的凋亡过程,其中Bcl-2家族成员发挥了重要的调节功能,而Bcl-2基因是最早发现具有抗凋亡活性的调节因子。因此,其活性改变很大程度上会影响精子发生,导致少精子症和无精子症的发生。已有的研究显示,Bcl-2编码区基因多态性可通过影响其抗凋亡活性而与某些疾病的发生(如肿瘤和自身免疫性疾病)相关,但目前未见Bcl-2多态性与男性生精障碍关系的报道。本研究从分子流行病学和分子生物学角度,通过人群研究和体外功能研究,初步探讨了Bcl-2编码区基因多态性与精子生成障碍(无精子症和严重少精子症)的相关性及其可能的分子机制。研究结果将为深入阐明男性精子发生的凋亡调控机制并进一步为临床男性不育症的个体化诊疗提供一定的理论和实践依据。第一部分Bcl-2基因多态性与原发性生精障碍关系的分子流行病学研究方法1、开展基于医院的病例-对照研究,根据流行学调查要求将已确诊的不孕不育门诊病人和已有一个孩子出生的正常男性作为研究对象,完成统一印制的调查表,采集血液等生物样本,并适当保存备用。2、不孕不育男性病人要求留置精液,按照WHO的要求用CASA仪进行精液质量分析。3、从研究对象的血液白细胞中用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,保存备用。4、按WHO精液中精子数量标准在收集的病例中挑选精液离心后检测没有精子(无精子症)和精子密度少于10×106/mL的(严重少精子症)个体作为病例。共有198例原发性非梗阻性无精子症病人和76例原发性严重少精子症病人以及183例生育正常的男性对照组成为本课题的研究对象。5、针对Bcl-2基因的结构,设计了两对用于扩增Bcl-2基因全长编码区的引物,进行PCR扩增后产物送公司进行序列测定。6、测序结果与野生型Bcl-2基因序列进行同源性比对,判别存在于Bcl-2基因编码区内的变异,查找可能的单核苷酸多态性位点(SNPs)。7、运用统计学方法分析Bcl-2不同基因型在病例和对照中的分布差异,探讨Bcl-2编码区基因多态性与无精子症和严重少精子症的相关性。结果1、根据Bcl-2蛋白表达的特性,设计了针对扩增Exon 2和Exon 3全长序列的引物,通过PCR和凝胶电泳,分别得到了639bp和185bp的扩增产物。以此产物经测序后,通过网上序列比对,获得编码区基因变异位点,确认Bcl-2基因变异类型。2、通过测序,共发现3种Bcl-2基因变异类型,都发生在Exon2,分别为A21G (rs1801018)、G127A(rs1800477),和C300T (rs61733416),可见有2种同义突变(Thr7Thr和Ala100Ala)和1种错义突变(Ala43Thr)。A21G、G127A和C300T这3种基因型在正常生育男性人群中的比例分别为14.7%(杂合型AG为13.6%,纯合型GG为1.1%)、15.3%(杂合型GA为13.7%,纯合型AA为1.6%)和7.7%(全部为杂合型CT)。其中C300T(rs61733416)在中国汉族人群中系首次报道。3.分析了上述3种基因型在病例和对照人群中的分布情况,结果显示3种基因型在严重少精症中的比例分别为14.5%、14.5%和6.6%,与对照接近,两组无显著性差异;无精症组中3中基因型的比例分别为8.6%、7.1%和3.0%,都低于对照组和严重少精症组,且G127A与对照组相比有明显差异(P=0.010),主要体现于杂合型(P=0.034)。携带GA基因型的个体罹患原发性无精子症的风险减少(调整后OR=0.403,95%CI=0.189-0.857),基因型GA和AA合并后结果改变不大(调整后的OR=0.448,95% CI=0.226-0.889)。4、从Bcl-2编码区的变异数量来分析,结果发现在对照和无精子组中变异个数是有差异的,携带1-2个变异的个体罹患无精子症的风险明显降低(调整后的OR=0.37,95%CI=0.23-0.60)。三个多态性位点的单倍型和危险位点联合分析发现与野生型相比,21G-127A-300C、21G-127G-300C和21A-127G-300T显著降低了原发性无精子症患病的风险性,OR分别为0.43(95%CI=0.24-0.80)、0.48(95%CI=0.26-0.89)和0.35(95%CI=0.13-0.92)。结论1、在中国汉族男性中共发现了3种Bcl-2基因变异类型,分别为A21G、G127A和C300T,其中C300T为汉族人群中首次报道。2、各基因型在严重少精子症患者和对照人群中的分布基本接近,但都高于无精子症人群,且G127A在无精子症中的比例显著低于对照组,可显著降低罹患原发性无精子症的风险。此外,无论是变异数量还是单倍型分析,这种趋势都依然存在。第二部分Bcl-2 Ala43Thr变异体的功能研究关于Bcl-2基因多态性的研究主要集中于自身免疫疾病和肿瘤,但是报道的结果不一致。本研究选择第一部分有显著意义且属错义突变的Bcl-2变异体G127A(Ala43Thr)为研究对象,通过体外功能学研究,探讨该位点变异对Bcl-2蛋白活性的影响因而改变精子发生特别是无精子症发生的分子机制。方法1、构建含Bcl-2野生型和Ala43Thr变异体的表达载体:pEGFP-C1-Bcl-2(Wild-type)和pEGFP-C1-Bcl-2(Ala43Thr),PCR、酶切及测序鉴定含有不同基因型的Bcl-2 cDNA序列。2、将不同基因型Bcl-2重组质粒转染到HeLa细胞中,在培养液中孵育24h后提取细胞总蛋白用Western Blot检测Bcl-2转染效率,确认获得Bcl-2基因高表达的细胞模型。3、用0.0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0μM Paclitaxel(紫杉醇)分布处理转染细胞,用MTT检测细胞的活性,观察不同基因型Bcl-2蛋白对Paclitaxel所致细胞毒性的影响。4、以0.1μM Paclitaxel处理转染细胞24h,用Hoechst 33258和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡情况。5、以0.1μM Paclitaxel处理转染细胞24h,用Western blot分析细胞中Bcl-2表达情况和磷酸化水平,以及与Bcl-2相关的Bax和P53蛋白的表达情况。同时分析Cleaved-PARP的情况。6、生物信息学软件分析预测Wild-type和Ala43Thr Bcl-2蛋白结构的差异以及与Bax结合能力的改变。结果1、pEGFP-C1-Bcl-2(Wild-type)和pEGFP-C1-Bcl-2(Ala43Thr)质粒经双酶切、PCR以及测序鉴定:野生型Bcl-2与GenBank中AY220759序列一致,而Ala43Thr则含有一个碱基突变,即127位碱基G→A(Ala43Thr)。2、在细胞转染质粒24h时用WesternBlot检测Bcl-2蛋白表达情况,结果此时在HeLa细胞内Bcl-2的表达量相比空载细胞提高了约20倍,并且Wild-type和Ala43Thr的表达量接近,说明在细胞内的Bcl-2转染效率相近,两者具有可比性。3、转染不同载体HeLa细胞活性在0.1和0.5μM Paclitaxel处理24h时已有显著性差异(P<0.05),在0.5、1.0和2.0μM处理后转染Wild-type Bcl-2的HeLa细胞活性均显著高于转染Ala43Thr Bcl-2或Vector Control细胞(P<0.05)。4、不同基因型Bcl-2对细胞凋亡的影响。Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学改变,凋亡的细胞核呈致密浓染、碎片状,未凋亡的细胞核呈圆形或椭圆形。0.1μM Paclitaxel诱导细胞凋亡24h后,Wild-type Bcl-2的HeLa细胞凋亡率是44.4%,而Ala43Thr Bcl-2细胞的凋亡率则为53.3%,与空白细胞接近,差异显著(p<0.05);利用流式细胞仪测定相同条件处理的细胞凋亡情况结果也同样证实:Wild-type Bcl-2的HeLa细胞凋亡率是28.6%,而Ala43Thr Bcl-2细胞的凋亡率则为36.2%,差异显著(p<0.05)。5、从Bcl-2总表达量分析,Wild-type和Ala43Thr Bcl-2是表达量之比为1.1:1.2,但是Bcl-2的磷酸化水平Ala43Thr Bcl-2高于Wild-type(1.53:1.00);与凋亡的效应指标一致,Cleaved-PARP的量在Wild-type细胞内显著低于Ala43Thr和VectorControl细胞(P<0.05)。但是与Bcl-2结合有关的蛋白比如Bax和P-53等的表达却未受Bcl-2不同基因型高表达的影响。6、生物信息学软件预测Wild-type和Ala43Thr Bcl-2蛋白结构,结果显示,Ala43Thr位于Bcl-2柔性结构区域(FLD),此多态性位点软件预测可以改变Bcl-2蛋白FLD的空间构像,一定程度上改变了与Bax的结合能力,可能与凋亡调节功能有关。结论1、Ala43Thr Bcl-2可显著降低其抗凋亡能力,增加细胞对紫杉醇的敏感性;2、虽然Ala43Thr Bcl-2未影响Bax和P53的表达,但其磷酸化水平发生改变,可能是其活性改变的潜在机制;3、Ala43Thr改变了Bcl-2蛋白的FLD区域的空间构象,可能影响Bcl-2与Bax等结合能力进而影响了其抗凋亡的活性。总之,综合人群和体外功能研究结果,我们初步得出结论:Bcl-2基因Ala43Thr多态性可显著降低原发性无精子症的发生风险,可能的分子机制是:正常人群中存在一定比例的Bcl-2 Ala43Thr变异,可以诱导正常的生精细胞凋亡,促进精子的正常发生;而在无精子症中,低发生率的Ala43Thr变异相对增强了Bcl-2蛋白抗凋亡的活性,破坏了机体维持正常生殖细胞凋亡的平衡状态,结果导致大量堆积的生精细胞发生退化,并进而在生精小管中发生空泡化,最终导致无精子症的发生。

全文目录

中文摘要  5-12
英文摘要  12-20
前言  20-25
第一部分 Bcl-2 基因多态性与原发性生精障碍关系的分子流行病学研究  25-45
  材料与方法  25-32
    1. 研究对象  25
    2. 调查方法  25-26
    3. 实验方法  26-31
    4. 质量控制  31
    5. 统计分析  31-32
  结果  32-40
    1. 病例和对照组的人口学特征分析  32-33
    2. PCR 产物和测序结果  33-35
    3. 遗传平衡检验  35
    4. Bcl-2 基因多态性与精子生成障碍的关系  35-38
    5. Bcl-2 基因单倍型分析  38
    6. 少精子症病例中精液质量的比较分析  38-40
  分析与讨论  40-45
第二部分 Bcl-2 Ala43Thr 变异体的功能研究  45-70
  材料与方法  45-57
    1. 主要仪器  45-46
    2. 细胞、菌株及质粒来源  46
    3. 主要试剂  46
    4. 主要试剂配制  46-48
    5. 质粒构建  48-52
    6. 细胞培养及模型的建立  52
    7. 检测指标及方法  52-56
    8. 统计分析方法  56-57
  结果  57-65
    1. Bcl-2 WT和Ala43Thr表达载体的构建  57
    2. Bcl-2 WT 和 Ala43Thr 高表达 HeLa 细胞模型建立  57-58
    3. Bcl-2 Ala43Thr 变异对紫杉醇诱导的细胞毒性的影响  58-60
    4. Bcl-2 Ala43Thr 变异对紫杉醇诱导的细胞凋亡的影响  60-62
    5. Bcl-2 Ala43Thr 变异对紫杉醇诱导的凋亡相关蛋白表达的影响  62-64
    6. Bcl-2 Ala43Thr 的空间构象分析  64-65
  分析与讨论  65-69
  小结  69-70
参考文献  70-78
文献综述  78-95
  Bcl-2 的功能及与生殖细胞凋亡的关系  78-90
    参考文献  85-90
  Bcl-2 基因多态性与疾病相关性的研究进展  90-95
    参考文献  93-95
主要创新点  95-96
附录  96-102
  1. 主要缩略词中英文对照表  96-98
  2. 在读期间已(待)发表的论文及获奖情况  98-99
  3. 支持本研究的基金  99-100
  4. 伦理学证明  100-101
  5. 知情同意书  101-102
致谢  102

Bcl-2编码区基因多态性与男性生精障碍的相关性及机制研究

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