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辣椒平对人超极化激活的环核苷酸门控通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的影响

作　者: 左广锋
导　师: 陈绍良
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 辣椒平(Capsazepine) 人HCN2和HCN4通道真核表达载体
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 30次
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内容摘要

目的:辣椒素受体阻滞剂辣椒平(Capsazepine)对参与神经源性疼痛的HCN1通道有阻滞作用,可能用于临床上治疗神经源性疼痛,但辣椒平是否对心脏中主要表达的且参与心脏节律形成的HCN2和HCN4通道产生影响,目前尚未报道。本研究旨在探讨辣椒平对HCN2和HCN4通道的影响。方法:(1)构建人HCN2和HCN4真核表达载体;(2)DNA测序和酶切图谱验证;(3)脂质体法分别将pIRES2-HCN2-EGFP、pIRES2-HCN4-EGFP质粒及空载质粒(pIRES2-EGFP)转染入HEK293细胞中;(4)倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白GFP的表达;(5)反转录-聚合酶链反应法(reverse transcriptase PCR, RT-PCR)检测HEK293细胞中HCN2 mRNA和HCN4 mRNA的表达,并设计特异性引物,PCR扩增相对应的片段;(6)G418筛选获得稳定表达HCN2和HCN4的细胞株;(7)全细胞膜片钳技术检测HCN2和HCN4通道电流,灌流不同浓度的辣椒平,观察电流变化。结果:(1)成功构建pIRES2-HCN2-EGFP和pIRES2-HCN4-EGFP质粒,DNA测序证实HCN2和HCN4基因序列正常,未发现突变碱基,酶切图谱显示DNA片段与目的基因序列大小一致;(2)倒置荧光显微镜下,观察到转染pIRES2-HCN2-EGFP、pIRES2-HCN4-EGFP质粒和转染空载质粒(pIRES2-EGFP)的HEK293细胞均有绿色荧光表达,未转染质粒的HEK293细胞未见到绿色荧光;(3)转染pIRES2-HCN2-EGFP、pIRES2-HCN4-EGFP质粒的HEK293细胞分别扩增出230bp和233bp片段,空载组和对照组的HEK293细胞无相应特异性片段呈现;(4)600μg/μl G418筛选3-4周,获得稳定表达HCN2和HCN4的细胞株;(5)实验组的HEK293细胞能分别检测到对2 mM CsCl和40μM ZD7288敏感的内向超极化电流,证实了在HEK293细胞中HCN2/4起着If通道的作用,空载组和对照组未检测到电流;(6)辣椒平阻滞HCN2和HCN4通道电流:(i)辣椒平阻滞HCN2和HCN4通道电流的IC50(half-maximal inhibition)值分别为6.1μM和5.8μM,在0.1μM-10μM之间,抑制率随浓度增加而增加,超过50μM,浓度值增加时抑制率变化不明显;(ii)在-130 mV时, HCN2和HCN4通道电流密度分别为-29.46±3.0 pA/pF(n = 10)和-31.51±3.44 pA/pF(n = 8),灌流辣椒平后, HCN2和HCN4通道电流密度分别为-19.67±4.6 pA/pF(n = 8, P < 0.05)和-17.86±4.1p A/pF(n = 6, P < 0.05);(iii)辣椒平使HCN2/4通道激活曲线向超极化方向移动。结论:(1)EGFP作为报告基因可快速的追踪待检测蛋白的表达;(2)pIRES2-HCN2-EGFP、pIRES2-HCN4-EGFP质粒转染HEK293细胞,经G418抗性筛选,获得了稳定表达hHCN2和hHCN4细胞株,建立了异源性表达HCN2和HCN4通道的模型,在此模型基础上可以方便的对离子通道进行更深入的研究以及开展以HCN通道为治疗靶点的药物的研发;(3)辣椒平抑制人HCN2和HCN4通道电流,临床应用其治疗HCN1通道参与的神经源性疼痛时可能会引起与HCN2和HCN4功能相关的副反应;(4)辣椒平抑制人HCN2和HCN4通道电流呈浓度依赖性,并使得两种通道的激活曲线向超极化方向移动,其作用机制可能与通道蛋白跨膜片段(S2-S4)相关。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
引言  12-14
第一部分人HCN2和HCN4真核表达载体的构建及检测  14-33
  材料和方法  14-27
  实验结果  27-32
  讨论  32-33
第二部分人HCN2、HCN4真核表达载体在HEK293 细胞的表达  33-43
  材料和方法  33-38
  结果  38-41
  讨论  41-43
第三部分辣椒平对HCN2、HCN4通道的影响  43-52
  材料和方法  43-45
  结果  45-50
  讨论  50-52
结论  52-53
参考文献  53-59
综述  59-81
  参考文献  69-81
攻读硕士学位期间撰写的论文  81-82
致谢  82

辣椒平对人超极化激活的环核苷酸门控通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的影响

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