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猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株M基因序列分析、原核表达研究及真核表达载体构建

作　者: 韩国全
导　师: 郭万柱；王印
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 M基因 扩增克隆 生物信息学分析 原核表达研究 真核表达载体构建
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


本研究以TGEV SC-Y株的毒种为材料扩增克隆M基因，并对其序列进行生物信息学分析；同时利用获得的M基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建研究。主要研究结果如下： Ⅰ、参照GenBank中登录号AJ271965的TGEV基因序列，利用自行设计的一对引物，以ST细胞增殖培养的SC-Y株TGEV为材料，采用RT-PCR技术扩增出M基因，TA克隆构建获得其重组质粒pMD18-TrM。序列分析显示SC-Y株与GenBank中登录的TS、TFI、Purdue、Purdue-115、PUR46-MAD、96-133、HN2002、FS772／70、TO14株M基因核苷酸序列同源性达94％以上，氨基酸序列同源性达91％以上，表明不同毒株M基因保守性较高。M蛋白基因系统进化及其氨基酸同源性分析显示SC-Y株与美国Purdue株亲缘关系较近，同时研究发现我国TS、TFI株分别与韩国HN2002株、英国FS772／70株亲缘关系较近，而我国SC-Y、TS、TFI三株之间亲缘关系则较远，这从一定程度上说明我国TGEV可能为外国输入性。M蛋白氨基酸二级结构综合参数分析、信号肽及跨膜区预测显示，SC-Y株M前体蛋白存在有四个跨膜区(氨基酸残基位于1-16，53-75，86-104，113-135)，其中1-16位为信号肽序列；成熟M蛋白(去除信号肽)为三个跨膜区，其N端位于病毒膜外区，而C端位于病毒膜内区。SC-Y株成熟M蛋白高级结构预测显示其功能结构域在N端主要集中于氨基酸残基8-21，该区域与M蛋白的生物学功能关系密切；预测综合分析显示可形成有效抗原表位的区域在N端氨基酸残基4-30或其附近。 Ⅱ、以pMD18-TrM为材料，扩增、TA克隆构建获得M蛋白去信号肽序列基因的重组质粒pMD18-TΔM。运用DNA技术，将pMD18-TrM、pMD18-TΔM中M蛋白基因及其去信号肽序列基因分别转移定向克隆到pET32a(+)中，获得重组原核表达载体pET32a(+)-rM、pET-32a(+)-ΔM。构建成功后分别转化高效表达菌株E．coli BL21(DE3)进行表达研究。SDS-PAGE电泳检测结果显示，原核重组表达载体pET32a(+)-rM未成功表达出预期目的融合蛋白Trx-M；原核重组表达载体pET-32a(+)-ΔM表达出预期融合目的蛋白Trx-ΔM，其表达量有待进一步研究；Western Blotting检测结果显示，表达的去信号肽目的融合蛋白Trx-ΔM具有特异的生物学免疫原性。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
前言  10-12
实验研究  12-66
  第一章 猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株M基因的扩增克隆、序列及高级结构分析  12-35
    1 材料和方法  13-20
      1.1 实验材料  13-14
        1.1.1 种毒、传代细胞、菌株及克隆载体  13
        1.1.2 主要试剂  13
        1.1.3 主要仪器  13
        1.1.4 生物信息学相关软件与资源  13-14
      1.2 实验方法  14-20
        1.2.1 技术路线  14
        1.2.2 TGEV病毒增殖  14-15
        1.2.3 RNA模板的制备  15
        1.2.4 TGEV-M蛋白基因的扩增  15-16
        1.2.5 TGEV-M蛋白基因RT-PCR扩增产物的TA克隆  16-19
        1.2.6 TGEV SC-Y株M蛋白基因、氨基酸序列及高级结构分析  19-20
    2 结果  20-26
    3 讨论  26-32
    4 结论  32-33
    参考文献  33-35
  第二章 猪传染性胃肠炎M蛋白在原核表达载体pET-32a(+)中表达研究  35-56
    1 材料和方法  35-43
      1.1 实验材料  35-37
        1.1.1 菌株和质粒  35-36
        1.1.2 主要试剂及其配制  36-37
        1.1.3 主要仪器  37
      1.2 实验方法  37-43
        1.2.1 实验技术路线  37-38
        1.2.2 M蛋白去信号肽基因TA克隆质粒的构建  38-39
        1.2.3 M蛋白去信号肽基因重组pET32a(+)原核表达质粒构建  39-40
        1.2.4 M蛋白完整阅读框重组pET32a(+)原核表达载体的构建  40
        1.2.5 M蛋白及其去信号肽蛋白在原核表达系统中的表达研究  40-43
    2 结果  43-50
    3 讨论  50-54
    4 结论  54-55
    参考文献  55-56
  第三章 猪传染性胃肠炎病毒M蛋白基因真核表达载体的构建  56-66
    1 材料和方法  56-60
      1.1 实验材料  56-57
        1.1.1 菌株、质粒和表达载体  56-57
        1.1.2 主要试剂  57
        1.1.3 主要仪器  57
      1.2 实验方法  57-60
        1.2.1 实验技术路线  57
        1.2.2 引物设计  57-58
        1.2.3 TGEV-M蛋白基因的质粒PCR扩增及产物的回收纯化  58
        1.2.4 TGEV-M蛋白基因的质粒PCR扩增产物TA克隆  58-59
        1.2.5 TGEV-M基因在pEGFP-C1表达质粒中的定向克隆  59-60
    2 结果  60-62
    3 讨论  62-64
    4 结论  64
    参考文献  64-66
文献综述  66-79
  猪传染性胃肠炎病毒研究进展  66-75
    1 TGEV基因组结构及其表达  66-68
      1.1 病毒基因组结构  66-67
      1.2 病毒基因表达  67-68
    2 TGEV蛋白的结构与功能  68-71
      2.1 非结构蛋白  68
      2.2 结构蛋白  68-71
        2.2.1 TGEV-S蛋白  69
        2.2.2 TGEV-M蛋白  69-70
        2.2.3 TGEV-N蛋白  70
        2.2.4 sM蛋白  70-71
    3 TGEV基因工程的研究  71-72
      3.1 TGEV基因工程载体研究  71
      3.2 TGEV基因工程疫苗的研究  71-72
    4 TGEV分子生物学诊断技术  72
    5 我国TGEV研究近况  72-74
    6 问题与展望  74-75
  参考文献  75-79
致谢  79-80
发表文章  80-81
附录  81-85

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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