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三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究

作　者: 孙培欣
导　师: 秦路平
学　校: 第二军医大学
专　业: 生药学
关键词: 三尖杉内生真菌分子鉴定抗稻瘟霉抗真菌抗肿瘤次生代谢产物
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

内生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌,包括营表生的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根菌。近年来的研究发现,植物内生真菌具有抗真菌、抗肿瘤和抗氧化等作用,同时与植物有一定的共生进化关系。这些作用的存在与植物内生真菌产生的新天然产物,甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物有很大的相关性,因而对植物内生真菌的研究可以寻找植物与内生真菌的协同进化关系,同时又是一个寻找天然产物的重要途径。本课题以药用植物三尖杉(Cephalotaxus fortunei)为研究材料,在内生真菌的种类组成、内生真菌活性菌株的筛选及内生真菌菌株次生代谢产物探索等方面进行研究。取得如下结果：从浙江建德地区三尖杉样品树皮中共分离得到内生真菌160株,经过形态鉴定与分子鉴定,确定分属于10个目、14个科、16个属一共20个分类单元。根据形态鉴定的结果及对不产孢菌株形态型的划分结果,选取20个分类单元中的三尖杉内生真菌的代表菌株,以稻瘟霉(Pyricularia oryzae P-2b)为筛选模型,初步筛选内生真菌发酵产物活性,其中8株(40.0%)有抑制稻瘟霉活性。进一步体外抗真菌、抗肿瘤研究发现,5株(25.0%)内生真菌产物的抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、薰烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)活性较好,4株(20.0%)内生真菌产物的抗胃癌细胞(MKN45)、肠癌细胞(LOVO)、肝癌细胞(HepG2)、白血病细胞(HL-60)活性较好。其中,以菌株S361(Trichoderma atroviride)的抗真菌活性与S261 (Penicillium sp.)的抗肿瘤活性最为显著。选取菌株S361与菌株S261,分别大量发酵,对其发酵产物的萃取产物进行化学分离。采用柱层析和制备薄层色谱等方法从S361发酵液的乙酸乙酯部位(AEF)中分离得到20个化合物,经波谱学分析以及对照品比较的方法,鉴定了其中15个化合物,其中3个trichodermanin A, trichoderiols A and B为新化合物。从S261发酵液的乙酸乙酯部位(AEF)中分离得到11个化合物,经波谱学分析以及对照品比较的方法,鉴定了其中5个,均为已知化合物。对3个新化合物分别进行了抗真菌以及抗肿瘤活性检测。发现trichodermanin A对于白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)有较好的抑制作用；trichoderiols A对于新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)有较好的抑制作用；trichoderiols B对于新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)有较好的抑制作用。3个化合的抗肿瘤活性一般,对胃癌细胞(MKN45)、肠癌细胞(LOVO)、肝癌细胞(HepG2)、白血病细胞(HL-60)均无明显的抑制活性。通过以上研究,得到一些有意义的结果,主要包括：(1)从三尖杉中分离得到160株内生真菌,对部分菌株进行了鉴定,并且筛选出了若干生物活性较好的菌株(S261,S361等),表明三尖杉内生真菌物种多样性丰富,是庞大的微生物资源库；(2)菌株S361,S261的乙酸乙酯部位生物活性较好,具有丰富的化学成分；(3)分离获得2株生物活性较强、产量较高、相对稳定的内生真菌,通过柱层析对这2株内生真菌的发酵产物进行分离纯化,得到单体化合物31个,最终鉴定出20个化合物,均与三尖杉中已报道的主要成分不同；(4) trichodermanin A, trichoderiols A and B为新化合物,且有一定的活性,进一步表明内生真菌是重要的新药资源库。综上所述,本课题为开发应用三尖杉内生真菌及其活性产物提供了一定的理论和化学基础。三尖杉内生真菌具有良好的生物活性,有必要对其进行深入研究,从中发现结构新颖、活性较好的天然产物。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
前言  11-14
  一三尖杉的研究概述  11
  二植物内生真菌的研究概述  11-14
第一章三尖杉真菌分离方法的确立  14-21
  1.1 材料、仪器及试剂  14-16
  1.2 方法  16-19
  1.3 结果与讨论  19-21
第二章三尖杉内生真菌的分离、纯化及鉴定  21-28
  2.1 材料、仪器及试剂  21-22
  2.2 方法  22-24
  2.3 结果与讨论  24-28
第三章三尖杉内生真菌活性菌株的筛选  28-35
  3.1 材料、仪器及试剂  28-29
  3.2 方法  29-31
    3.2.1 抗稻瘟霉活性的研究  29-31
    3.2.2 抗真菌活性的研究  31
    3.2.3 抗肿瘤活性的研究  31
  3.3 结果与讨论  31-35
第四章三尖杉内生真菌次生代谢产物成分探索  35-53
  4.1 材料、仪器及试剂  35
  4.2 方法  35-36
  4.3 结果与讨论  36-53
第五章三尖杉内生真菌次生代谢产物成分活性研究  53-56
  5.1 材料、仪器及试剂  53
  5.2 方法  53-54
    5.2.1 抗真菌活性的研究  53
    5.2.2 抗肿瘤活性的研究  53-54
  5.3 结果与讨论  54-56
第六章总结与讨论  56-59
  6.1 三尖杉内生真菌分离过程中，表面消毒方法的确立  56
  6.2 三尖杉内生真菌的鉴定  56
  6.3 三尖杉内生真菌活性菌株的筛选  56-57
  6.4 次生代谢产物研究  57
  6.5 小结  57-59
附录一部分三尖杉内生真菌菌种照片  59-60
附录二部分化合物光谱图  60-69
参考文献  69-76
文献综述  76-104
  References  99-104
攻读硕士学位期间发表论文情况  104-109
致谢  109

三尖杉内生真菌次生代谢产物及其活性研究

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