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篦子三尖杉的组织培养及生物碱检测

作　者: 邹露
导　师: 曹福祥
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蓖子三尖杉愈伤组织培养悬浮细胞培养高三尖杉酯碱次生代谢
分类号: S791
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast.)是一种古老孑遗植物,它的叶、枝、种子、根可提取多种植物碱,对治疗白血病和淋巴肉瘤等有一定的疗效,同时又是材用和园林绿化用的优良树种。随着篦子三尖杉的开发利用及其潜在价值的发现,篦子三尖杉的快速繁殖越来越显示出它的重要意义。但到目前为止,篦子三尖杉的组织培养在国内外开展极少,更未在生产上推广应用。本研究运用植物细胞培养技术,分别对篦子三尖杉愈伤组织的诱导,愈伤组织培养体系和悬浮细胞培养体系的建立及其高三尖杉酯碱代谢的调控等方面的研究。主要研究结果如下：(1)湖南地区三种三尖杉(普通三尖杉、篦子三尖杉、粗榧)叶片中高三尖杉酯碱的含量高低为：篦子三尖杉>粗榧>普通三尖杉。(2)篦子三尖杉愈伤组织较容易诱导,各种培养基很大范围内都可以产生愈伤组织。其中最佳愈伤组织诱导培养基为：MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1KT。篦子三尖杉外植体取材应选择在3-5月间的嫩叶叶基,其愈伤组织诱导率最高达100%,且外植体的污染率低。(3)在愈伤组织的继代培养中,以愈伤组织诱导培养基为基础,研究了蔗糖浓度、愈伤组织接种量、培养基pH值和植物激素对三尖杉愈伤组织生长的影响。结果表明,以培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1KT,蔗糖30g·L-1,接种量2.0g·40mL-1,pH值为5.8的条件下,愈伤组织增值效果最好。研究了愈伤组织培养中培养条件及天然有机营养物质对高三尖杉酯碱代谢的影响。试验结果显示：添加蛋白胨0.1g·L-1时,愈伤组织鲜重增长率最高达到556.44%,但高三尖杉酯碱含量低,而水解酪蛋白为0.1g·L-1时不仅愈伤组织干重增长率提高到330.62%,而且高三尖杉酯碱的含量也提高到16.8μg·g-1(4)在悬浮细胞培养中,蔗糖浓度低于30 g·L-1时有利于细胞生长；摇床转速为80 r·min-1,pH为5.8的培养条件有利细胞生长；高的接种量(2.0g·30m1-1)有利于细胞生物量合成；以培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1KT,添加蔗糖30g·L-1,每30～35d继代一次,成功地建立了篦子三尖杉悬浮细胞培养体系,细胞增长率达到852.93%。(5)研究了培养条件、高三尖杉酯碱代谢前体对高三尖杉酯碱代谢的影响。结果表明培养基起始pH值为6.2时,高三尖杉酯碱的代谢量最高；添加酪氨酸0.1mg·L-1+苯丙氨酸0.5 mg·L-1的代谢前体能显著提高高三尖杉酯碱的代谢,高三尖杉酯碱的含量比对照提高了77%,为8.5μg·g-1(6)篦子三尖杉固体培养和液体培养愈伤组织中高三尖杉酯碱的检测：对比了篦子三尖杉固体培养的愈伤组织和篦子三尖杉悬浮培养的愈伤组织中高三尖杉酯碱的含量。用HPLC进行定量分析,发现后者的高三尖杉酯碱含量明显高于前者。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
1 绪言  11-31
  1.1 篦子三尖杉的生物学特性  11-17
    1.1.1 外部形态  12
    1.1.2 内部结构  12-15
    1.1.3 化学成分  15-16
    1.1.4 地理分布  16
    1.1.5 生态与群落学特点  16
    1.1.6 篦子三尖杉的分类位置  16-17
  1.2 篦子三尖杉的研究简史  17-20
    1.2.1 篦子三尖杉的系统分裂学研究  17
    1.2.2 篦子三尖杉的形态解剖学研究  17
    1.2.3 篦子三尖杉的孢粉学学研究  17-18
    1.2.4 篦子三尖杉的细胞学研究  18
    1.2.5 篦子三尖杉的分子生物学研究  18
    1.2.6 篦子三尖杉的植物化学研究  18-19
    1.2.7 篦子三尖杉的植物区系地理学研究  19
    1.2.8 篦子三尖杉的生物生态学和群落学研究  19
    1.2.9 篦子三尖杉的其他研究  19-20
  1.3 三尖杉属植物的组织培养和药用生物碱研究  20-23
    1.3.1 国内外对三尖杉属植物组织培养的研究现状与评述  20-21
    1.3.2 三尖杉属植物药用生物碱的研究简史和现状  21-23
  1.4 生物碱介绍  23-30
    1.4.1 生物碱的性质  23-25
    1.4.2 生物碱的分类  25-26
    1.4.3 生物碱的药用作用  26-28
    1.4.4 生物碱提取与纯化技术  28-30
  1.5 本课题的研究目的、意义和研究内容  30-31
    1.5.1 研究目的意义  30
    1.5.2 研究的主要内容  30-31
2 材料与方法  31-43
  2.1 试验材料与仪器试剂  31
    2.1.1 试验材料  31
    2.1.2 主要仪器和试剂  31
  2.2 试验操作技术  31-34
    2.2.1 三种三尖杉老叶生物碱含量测定  31-32
    2.2.2 愈伤组织培养试验操作技术  32-34
    2.2.3 篦子三尖杉悬浮培养试验操作技术  34
  2.3 试验设计  34-40
    2.3.1 篦子三尖杉愈伤组织诱导试验  34-36
    2.3.2 篦子三尖杉愈伤组织培养和次生代谢物调控试验  36-38
    2.3.3 篦子三尖杉悬浮细胞培养的优化试验  38-39
    2.3.4 篦子三尖杉悬浮细胞培养中的高三尖杉酯碱次生代谢调控研究  39-40
  2.4 试验分析方法  40-43
    2.4.1 愈伤组织诱导中感染率测定  40
    2.4.2 愈伤组织诱导率测定  40
    2.4.3 愈伤组织生物量测定  40-41
    2.4.4 篦子三尖杉悬浮细胞培养参数的测定  41
    2.4.5 愈伤组织和悬浮细胞体内高三尖杉酯碱的提取及含量测定  41-43
3 结果与讨论  43-70
  3.1 湖南地区三种三尖杉生物碱含量测定  43-44
    3.1.1 高三尖杉酯碱标准品浓度与吸光度的关系  43
    3.1.2 回收率计算  43-44
    3.1.3 三种三尖杉中三尖杉总碱类含量测定  44
  3.2 愈伤组织诱导  44-52
    3.2.1 外源激素对愈伤组织诱导的影响  44-47
    3.2.2 四因素三水平正交试验探讨激素对愈伤组织诱导的影响  47-48
    3.2.3 取材季节和取材部位对外植体感染率和愈伤组织诱导率的影响  48-52
  3.3 愈伤组织培养及高三尖杉酯碱代谢的调控  52-60
    3.3.1 蔗糖浓度、接种量和pH值对愈伤组织生长的影响  52-56
    3.3.2 植物生长素对愈伤组织生长的影响  56-57
    3.3.3 天然有机物对愈伤组织生长及其高三尖杉酯碱含量的影响  57-60
    3.3.4 愈伤组织生长曲线  60
  3.4 篦子三尖杉悬浮细胞培养的研究  60-68
    3.4.1 细胞生长曲线和高三尖杉酯碱含量变化曲线的研究  60-62
    3.4.2 接种量、摇床转速和蔗糖浓度对篦子三尖杉细胞生长的影响  62-66
    3.4.3 pH值对细胞生长及其高三尖杉酯碱含量的影响  66-67
    3.4.4 前体对细胞生长和高三尖杉酯碱代谢的影响  67-68
  3.5 不同培养方式对愈伤组织中高三尖杉酯碱含量的影响  68-70
4 结论  70-74
  4.1 湖南地区三种三尖杉叶片中高三尖杉酯碱的含量高低  70
  4.2 愈伤组织诱导  70-71
  4.3 愈伤组织培养及次生代谢产物的调控  71-72
  4.4 篦子三尖杉悬浮细胞培养及高三尖杉酯碱代谢研究  72-73
  4.5 篦子三尖杉愈伤组织和悬浮细胞培养细胞生长周期的研究  73
  4.6 篦子三尖杉愈伤组织和悬浮细胞中高三尖杉酯碱的检测  73-74
5 展望与创新  74-75
参考文献  75-81
附录A  81-82
附录B  82-83
附录C  83-84
致谢  84

篦子三尖杉的组织培养及生物碱检测

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