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耐辐射奇球菌特有蛋白PprI的相互作用蛋白筛选

作　者: 廖永强
导　师: 何淑雅
学　校: 南华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 耐辐射奇球菌 pprI蛋白酵母双杂交系统相互作用蛋白免疫共沉淀
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,简称DR)是一种对电离辐射、紫外线、强氧化剂和化学诱变剂等均具有超强耐受力的极端微生物。DR菌的pprI突变株研究发现,pprI的缺失导致DR菌抗辐射能力显著降低,而pprI补偿株的辐射抗性得到完全恢复,提示pprI基因在耐辐射球菌的极端抗性中起重要作用。本研究将利用酵母双杂交及免疫共沉淀技术筛选并鉴定与PprI相互作用的蛋白质,试图了解以PprI为核心的复杂调控网络组成,为进一步明确DR菌辐射损伤的高效修复原理、探究DR菌耐辐射的分子机制做铺垫。方法:构建钓饵载体pGBKT7–pprI,将pGBKT7–pprI与pGADT7共转化入酵母菌AH109中,分析其表达产物是否影响酵母菌的生长以及能否自激活报告基因转录。在本实验室前期构建好的两种耐辐射奇球菌基因组文库(pGADT7–DNADR/Sau3AI和pGADT7–DNADR/HpaII)基础上,应用酵母双杂交技术从DR菌基因组表达文库中筛选可能与PprI相互作用的蛋白。筛选得到的蛋白质和PprI在酵母菌AH109内免疫共沉淀进一步验证。应用CDD和SMART在线软件分别对筛选得到蛋白质的结构域分析及对PprI和SCS的蛋白相互作用链预测。结果:成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7–pprI,通过检测发现其没有自激活作用并且对酵母菌AH109无毒性作用,Western blot法证实转化的酵母AH109菌株能够正确表达Myc-PprI融合蛋白;利用酵母双杂交成功筛选到10个蓝色阳性克隆;免疫共沉淀结果显示,SCS(Succinyl CoA synthetase)蛋白可以在Myc抗体的免疫沉淀物中检测出来,同样在HA抗体的免疫沉淀物中也能分别检测到蛋白PprI;生物信息学分析表明筛选得到的10个蛋白质中有4个蛋白具有共同的NADB结构域。结论:(1)成功构建重组质粒pGBKT7–pprI和pGADT7–pprI,经自激活活性检测提示pGBKT7–pprI无自激活作用;(2)应用酵母双杂交技术从耐辐射奇球菌基因组表达文库中成功地筛选到SCS蛋白等10种可能与PprI存在相互作用的蛋白;(3)免疫共沉淀检测表明SCS与PprI的存在相互作用,PprI可能影响耐辐射奇球菌能量生成系统;(4)生物信息学预测提示PprI可能与筛选得到蛋白质的NADB结构域相互作用来调节耐辐射奇球菌代谢途径氧化还原酶的活性及其表达量。

全文目录

主要英文缩略词  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-16
材料与方法  16-23
第一部分酵母双杂交筛选与PprI 相互作用的蛋白质  23-38
  1.1 方法  23-28
  1.2 结果  28-38
第二部分免疫共沉淀验证相互作用蛋白  38-42
  2.1 方法  38-40
  2.2 结果  40-42
第三部分生物信息学分析  42-47
  3.1 方法  42
  3.2 结果  42-47
讨论  47-52
结论  52-53
参考文献  53-56
文献综述一  56-61
文献综述二  61-73
成果目录  73-74
致谢  74

耐辐射奇球菌特有蛋白PprI的相互作用蛋白筛选

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