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致病杆菌NMC-10新抗菌肽的纯化及性质研究

作　者: 肖尧
导　师: 杨秀芬
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 致病杆菌抗菌肽分离纯化抗菌活性
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抗菌肽广泛存在于动物、植物和微生物中,具有抗菌活性的小分子肽,其具有抗菌谱广,热稳定、对靶标不易产生抗性等优点而受到广泛关注。昆虫病原线虫共生菌致病杆菌是与斯氏线虫互惠共生的一类特异生境的肠杆菌科细菌,在昆虫病原线虫侵染宿主昆虫过程中能分泌多种活性物质以协助线虫成功侵染,具有对昆虫致病和与线虫互惠共生的双重特性。该类共生菌存在于昆虫病原线虫肠道内,生境特异,其产生的多种特异结构抗菌物质在农业和医药业已经显示了广阔的利用前景。为了挖掘新的抗菌肽资源,本论文以昆虫致病杆菌NMC-10菌株为研究材料,从其培养液中分离纯化出GP-19和EP-20两种新抗菌肽,两个新抗菌肽对多种细菌和植物病原真菌均具有良好抑制作用。本研究为培育农作物抗病新品种提供了宝贵的抗菌基因资源,也为新型生物农药的研发奠定了基础。主要研究结果如下:1、筛选获得一株高活性生防菌株。从致病杆菌和发光杆菌15个菌株中筛选到一株活性物质产量较高的菌株NMC-10,研究了该菌株的生长代谢特性,确定其代谢产物抑菌活性在震荡培养48h趋于稳定。2、通过分子生物学鉴定,确定了NMC-10菌株的分类地位。扩增了NMC-10菌株的16sRNA,构建了系统发育树,分析确定将该菌株归为Xenorhabdus budapestensis (Katalin Lengyel)。3、确定了以辣椒疫霉作为抗菌肽分离过程中的真菌指示菌。在一定的培养时间内,以NMC-10共生菌培养液粗提组分对不同真菌菌丝生长抑制率为标准,从辣椒疫霉、大丽轮枝菌、番茄灰葡萄孢菌等5个植物病原真菌中筛选确定辣椒疫霉为快速生物测定的指示菌。4、研究了NMC-10菌株培养液组分的部分理化性质。培养液主要活性成分具有耐热、酶稳定、pH稳定、能溶于有机溶剂等性质,为后续抗菌肽分离和纯化研究奠定了基础。5、建立了利用硫酸铵沉淀、离子交换层析和反相层析分离等技术分离抗菌肽的技术路线,纯化的两种抗菌肽纯度达到90%以上;两种抗菌肽均具有热稳定性和酶稳定性。6、用质谱ESI-MS-MS检测并De NOVO手动拼接测序获得两个含有19和20个氨基酸序列的抗菌肽,理论分子量分别为1658.93 Da和1787.96 Da,将其命名为GP-19和EP-20(对应于N端首个氨基酸种类及氨基酸的个数)。序列比对未发现同源序列,可能为首次发现的新抗菌肽。7、生物信息学分析显示,两个抗菌肽无信号肽,无跨膜结构,为胞外产物,属于阴离子多肽。二级结构均以无规则卷曲和延伸带为主,并利用软件对两种抗菌肽进行三级结构预测和同源建模,为后续多肽合成以及药物研发靶标位点的设计提供了有利条件。8、通过固相合成方法获得两种肽组分,合成的短肽经高效液相色谱纯化,纯度达98%以上。合成肽与天然肽组分均具有广谱抗菌活性。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-21
  1.1 共生细菌抗菌代谢物的研究概况  12-16
    1.1.1 致病杆菌和发光杆菌的生物学特征  12-13
    1.1.2 致病杆菌属共生菌产生的抗菌物质  13-14
    1.1.3 发光杆菌属共生菌产生的抗菌物质  14-15
    1.1.4 抗菌物质的编码基因  15-16
    1.1.5 共生菌抗菌物质的作用机制  16
  1.2 抗菌肽的研究进展  16-20
    1.2.1 抗菌肽的分类  17-18
    1.2.2 抗菌肽的结构特点及其对抗菌活性的影响  18-19
    1.2.3 抗菌肽的作用方式  19-20
  1.3 本研究目的和意义  20
  1.4 本研究技术路线  20-21
第二章高活性菌株的筛选、鉴定及抗菌代谢物理化性质  21-35
  2.1 材料与方法  21-26
    2.1.1 供试菌株  21
    2.1.2 培养基配方  21-22
    2.1.3 实验仪器与耗材  22
    2.1.4 实验方法  22-26
  2.2 结果与分析  26-34
    2.2.1 筛选获得高活性抗菌代谢物产生菌  26-29
    2.2.2 系统发育树的构建及分类地位  29
    2.2.3 NMC-10 菌株的代谢曲线  29-30
    2.2.4 抗菌活性检测方法的确立  30-31
    2.2.5 抗菌代谢物粗提技术  31
    2.2.6 植物病原真菌指示菌的确定  31-32
    2.2.7 抗菌粗提组分的部分理化性质  32-34
  2.3 小结与讨论  34-35
第三章抗菌肽的分离、纯化及质谱鉴定  35-55
  3.1 材料与方法  35-41
    3.1.1 供试指示菌  35
    3.1.2 实验仪器与耗材  35
    3.1.3 抑菌活性监测方法  35
    3.1.4 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  35-36
    3.1.5 Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳  36
    3.1.6 薄层层析分离  36-37
    3.1.7 液相色谱层析分离  37-41
    3.1.8 液相色谱检测抗菌肽纯度  41
    3.1.9 质谱鉴定  41
  3.2 结果与分析  41-53
    3.2.1 薄层层析分离与纯化  41-42
    3.2.2 离子交换层析纯化  42-44
    3.2.3 疏水层析纯化  44-46
    3.2.4 凝胶过滤层析(分子筛)纯化  46-47
    3.2.5 反相层析纯化  47-50
    3.2.6 液相检测抗菌组分纯度  50-51
    3.2.7 质谱鉴定抗菌肽  51-53
    3.2.8 序列比对  53
  3.3 小结与讨论  53-55
第四章抗菌肽的生物信息学分析  55-62
  4.1 材料与方法  55
    4.1.1 抗菌肽序列  55
    4.1.2 生物信息学分析方法  55
  4.2 结果与分析  55-61
    4.2.1 抗菌肽理化性质的分析  55-56
    4.2.2 抗菌肽信号肽分析  56-58
    4.2.3 抗菌肽跨膜结构分析  58-59
    4.2.4 抗菌肽的亲水性/疏水性分析  59
    4.2.5 抗菌肽二级结构预测  59-60
    4.2.6 三级结构预测和同源建模  60-61
  4.3 小结与讨论  61-62
第五章抗菌肽的合成及生物活性  62-70
  5.1 材料与方法  62-64
    5.1.1 供试菌株  62
    5.1.2 供试培养基  62
    5.1.3 实验仪器和耗材  62
    5.1.4 抗菌肽的合成  62-63
    5.1.5 液质联用鉴定和纯度检测  63
    5.1.6 EP-20 和GP-19 的生物活性测定  63
    5.1.7 部分理化性质测定  63-64
  5.2 结果与分析  64-69
    5.2.1 合成抗菌肽的质谱鉴定  64-65
    5.2.2 合成肽的纯度检测  65-66
    5.2.3 合成多肽与天然多肽的抑制活性比较  66-68
    5.2.4 合成肽的部分理化性质  68-69
  5.3 小结与讨论  69-70
第六章全文结论  70-71
参考文献  71-79
致谢  79-80
作者简历  80

致病杆菌NMC-10新抗菌肽的纯化及性质研究

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