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口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定

作　者: 刘新生
导　师: 王永录
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: FMDV 结构蛋白VP1 T细胞表位 H2-d限制性表位预测
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 43次
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内容摘要

表位肽疫苗作为一种新型疫苗,已成为口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)疫苗研究的热点之一。由于细胞免疫在口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的免疫应答中发挥着重要作用,而结构蛋白VP1内又包含着FMDV的主要抗原位点。因此,筛选和鉴定VP1蛋白有效的H-2Ld限制性T细胞抗原表位,不仅可为进一步研究针对FMDV自然宿主的T细胞抗原表位提供方法和依据,也可为进一步研制FMDV表位肽疫苗奠定基础。本研究通过扩增并测序,获得了完整的FMDV AF/72株VP1序列。采用密码子优化表达方法,在大肠杆菌中高效表达了该VP1蛋白。经过SDS-PAGE电泳及Western Blotting检测,其分子量与预期大小相符合,并且保持了良好的免疫原性。与此同时,利用相关生物信息学软件对VP1中潜在的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld限制性T细胞表位进行了预测分析,初步筛选并合成了30个10肽片段作为候选表位肽段。将VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备经VP1蛋白致敏的脾淋巴细胞,与30个候选表位肽段分别进行体外共培养刺激,经淋巴细胞增殖实验和γ干扰素ELISPOT实验,鉴定出2个H-2d限制性T细胞表位,即H-2Kd限制性T细胞表位pK1(AYHKGPFTRL)和H-2Dd限制性T细胞表位pD7(TGESADPVTT)。本研究筛选并鉴定了FMDV AF/72株结构蛋白VP1中的H-2d限制性T细胞表位,为FMDV T细胞表位的研究提供方法和依据,为进一步研制FMDV表位肽疫苗奠定了基础。此外,通过鉴定小鼠这一FMDV研究中常用动物模型的CTL T细胞表位,也有利于了解细胞毒性淋巴细胞在抗FMDV方面的作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-22
  1.1 口蹄疫 T 细胞表位研究进展  12-15
    1.1.1 口蹄疫病毒结构蛋白 T 细胞表位  13-14
    1.1.2 口蹄疫病毒非结构蛋白 T 细胞表位  14-15
    1.1.3 FMDV 表位疫苗概述  15
  1.2 细胞免疫检测方法  15-21
    1.2.1 体内功能检测  16
    1.2.2 体外表型检测  16-18
    1.2.3 体外功能检测  18-21
  1.3 研究的目的和意义  21-22
第二章 FMDV AF/72 株结构蛋白VP1 的扩增测序及T 细胞表位预测  22-30
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 毒株  22
    2.1.2 主要试剂  22-23
    2.1.3 引物设计  23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 病毒 RNA 提取  23
    2.2.2 反转录  23
    2.2.3 VP1 基因扩增  23-24
    2.2.4 目的片段的回收与纯化  24
    2.2.5 测序  24
    2.2.6 VP1 的结构分析及 T 细胞表位的预测  24-25
  2.3 结果  25-28
    2.3.1 VP1 基因的扩增  25
    2.3.2 VP1 基因序列测定及分析  25
    2.3.3 VP1 基因结构分析  25-27
    2.3.4 VP1 蛋白 T 细胞表位预测  27-28
  2.4 讨论  28-30
第三章 FMDV AF/72 株结构蛋白 VP1 的合成、密码子优化表达及小鼠致敏淋巴细胞的制备  30-40
  3.1 材料  30-31
    3.1.1 实验动物  30
    3.1.2 菌种及质粒  30-31
    3.1.3 主要试剂及器皿  31
  3.2 方法  31-33
    3.2.1 VP1 基因的密码子优化及合成  31
    3.2.2 原核表达载体的构建  31
    3.2.3 重组基因的诱导表达  31-32
    3.2.4 表达蛋白的纯化  32
    3.2.5 表达蛋白的SDS-PAGE 分析  32
    3.2.6 表达蛋白的Western blot 分析  32-33
    3.2.7 小鼠免疫  33
    3.2.8 致敏淋巴细胞的分离  33
  3.3 结果  33-38
    3.3.1 VP1 的优化及合成  33-34
    3.3.2 表达载体的构建与鉴定  34
    3.3.3 VP1 基因的表达  34-36
    3.3.4 VP1 表达蛋白的 Western blot 鉴定  36
    3.3.5 小鼠淋巴细胞的收集、培养及活力测定  36-38
  3.4 讨论  38-40
第四章 FMDV AF/72 株结构蛋白VP1 H-2D 限制性T 细胞表位的鉴定  40-45
  4.1 材料  40
  4.2 方法  40-41
    4.2.1 T 细胞增殖试验  40-41
    4.2.2 INF-γ ELISPOT 试验  41
  4.3 结果  41-43
    4.3.1 淋巴细胞体外增殖实验鉴定 CD8+T 细胞表位  41
    4.3.2 INF-γ ELISPOT 实验确认增殖实验的结果  41-43
  4.4 讨论  43-45
第五章全文结论  45-46
参考文献  46-53
致谢  53-54
作者简历  54

口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定

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