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FMDV 2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

作　者: 陈秋菊
导　师: 曹斌云
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 白细胞介素2 FMDV 2A 乳腺上皮细胞 Western blotting
分类号: Q782
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究构建了口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切肽介导的人白介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达。首先克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,最后用RT-PCR技术和Western blotting检测hIL-2基因与EGFP基因的表达。可为利用乳腺生物反应器生产具有协同作用的蛋白奠定基础。本研究获得以下结果:1.成功从人血液中提取RNA,并经RT-PCR、PCR、连接转化等试验后成功克隆出hIL-2基因,经测序分析后,表明该基因没有发生突变,可以用于后续试验。2.构建了以β-酪蛋白启动子作为调控序列,含有hIL-2基因和EGFP基因乳腺特异性的共表达载体,经酶切及测序鉴定后,证明载体构建正确,可以进行后续试验。3.以奶山羊乳腺组织为材料,利用组织块贴壁培养法培养出原代山羊乳腺上皮细胞,利用已长出上皮细胞的组织块重新移入另外一个培养皿中,成功培养出了纯化的山羊乳腺上皮细胞,且细胞经传代培养后,生长旺盛,状态良好,可以用于细胞转染试验。4.利用脂质体对乳腺上皮细胞进行转染,筛选出适合山羊乳腺上皮细胞的转染时间,转染两天后,在荧光显微镜下观察,转染重组质粒的细胞部分发出荧光,证明转染成功。提取了细胞的RNA,在mRNA水平上对目的基因进行了检测,结果显示hIL-2基因和EGFP基因在mRNA水平上得到表达,但仍需进一步进行蛋白检测。Western blotting检测结果显示,hIL-2蛋白和EGFP蛋白在细胞内都有表达,但也检测到了hIL-2/EGFP融合蛋白的存在,说明FMDV 2A发挥了剪切作用,但剪切作用并不完全。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
文献综述  11-24
  第一章转基因家畜动物的现状及未来  11-17
    1.1 转基因技术的发展  11
    1.2 转基因动物在生物医学上的应用  11-13
      1.2.1 利用转基因动物乳腺生产药物  11-12
      1.2.2 在转基因动物中生产抗体的研究  12
      1.2.3 利用转基因动物进行血液更换  12
      1.2.4 异种移植  12-13
    1.3 转基因动物在农业上的应用  13-14
      1.3.1 改变畜禽胴体组成  13-14
      1.3.2 促进泌乳  14
      1.3.3 增加毛的生产  14
      1.3.4 生产环保性动物  14
    1.4 转基因动物和疾病控制  14-15
      1.4.1 提高疾病抑制的转基因方案  14-15
      1.4.2 转基因技术应用于乳腺疾病治疗的研究  15
    1.5 新兴的转基因技术  15-16
      1.5.1 利用慢病毒转染受精卵和卵母细胞  15
      1.5.2 生产嵌合体一代  15-16
      1.5.3 RNAi（核糖核酸干扰）  16
    1.6 转基因动物的安全性  16-17
  第二章 FMDV 2A 在构建共表达载体中的研究进展  17-19
    2.1 利用 IRES 构建共表达载体  17
    2.2 构建融合蛋白表达载体  17
    2.3 利用自剪切多肽构建共表达载体  17-18
      2.3.1 FMDV 2A 的剪切机制  17
      2.3.2 FMDV 2A 在构建多顺反子表达载体中的应用  17-18
    2.4 问题与展望  18-19
  第三章白细胞介素2 的研究进展  19-20
    3.1 白细胞介素2 的一般性质  19
    3.2 白细胞介素2 的生物活性  19
    3.3 IL-2 的应用研究  19-20
  第四章本研究目的意义及技术路线  20-24
    4.1 本研究目的意义  20
    4.2 研究内容  20
      4.2.1 hIL-2 基因的克隆修饰  20
      4.2.2 构建具有FMDV2A 元件的hIL-2 表达载体  20
      4.2.3 细胞培养  20
      4.2.4 细胞转染和阳性筛选  20
      4.2.5 对目的基因在阳性细胞中的表达进行鉴定  20
    4.3 研究方法及技术路线  20-24
      4.3.1 hIL-2 基因的克隆  20
      4.3.2 FMDV2A 的获得  20
      4.3.3 β-酪蛋白调控序列的获得  20
      4.3.4 neo 基因的获得  20-21
      4.3.5 EGFP 基因的获得  21
      4.3.6 表达载体的构建  21-22
      4.3.7 细胞转染  22-23
      4.3.8 阳性细胞的检测  23-24
试验研究  24-51
  第五章 hIL-2 基因的克隆和修饰  24-32
    5.1 引言  24
    5.2 材料与方法  24-28
      5.2.1 试验材料  24-26
      5.2.2 试验方法  26-28
    5.3 结果与分析  28-31
      5.3.1 人血总RNA 的提取结果  28-29
      5.3.2 逆转录PCR 扩增hIL-2 CDS 区结果  29
      5.3.3 hIL-2 基因 CDS 区的克隆及鉴定结果  29-31
      5.3.4 菌落测序结果  31
    5.4 讨论  31
    5.5 小结  31-32
  第六章 FMDV 2A 介导的双基因乳腺特异性表达载体的构建  32-43
    6.1 引言  32
    6.2 材料与方法  32-36
      6.2.1 材料  32-33
      6.2.2 方法  33-36
    6.3 结果与分析  36-41
      6.3.1 山羊β-酪蛋白启动子片段克隆及鉴定结果  36-37
      6.3.2 EGFP 基因的克隆及鉴定结果  37-39
      6.3.3 neo 基因的克隆及鉴定结果  39-40
      6.3.4 双基因表达载体的构建结果  40-41
    6.4 讨论  41-42
    6.5 小结  42-43
  第七章奶山羊乳腺上皮细胞的培养  43-46
    7.1 引言  43
    7.2 材料与方法  43-44
      7.2.1 材料  43
      7.2.2 试验方法  43-44
    7.3 试验结果  44-45
      7.3.1 组织块贴壁培养法培养原代山羊乳腺上皮细胞  44
      7.3.2 细胞的传代培养结果  44-45
    7.4 讨论  45
    7.5 小结  45-46
  第八章重组质粒转染山羊乳腺上皮细胞及转染后的检测  46-51
    8.1 引言  46
    8.2 材料与方法  46-47
      8.2.1 试验试剂  46
      8.2.2 试验仪器及设备  46
      8.2.3 试验方法  46-47
    8.3 试验结果  47-49
      8.3.1 转染后细胞的EGFP 检测结果  47-48
      8.3.2 山羊乳腺上皮细胞hIL-2 和EGFP 的mRNA 检测结果  48-49
      8.3.3 阳性细胞中的IL-2 和EGFP 蛋白表达检测结果  49
    8.4 讨论  49-50
    8.5 小结  50-51
结论、创新点及不足  51-52
  1 结论  51
  2 创新点  51
  3 不足之处  51-52
参考文献  52-59
附录  59-68
致谢  68-69
作者简介  69

FMDV 2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

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