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表达人呼吸道合胞病毒结构蛋白的重组腺病毒及杆状病毒的构建与鉴定

作　者: 焦月盈
导　师: 何金生
学　校: 北京交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人呼吸道合胞病毒非复制型第一代腺病毒载体杆状病毒表达载体黏附蛋白融合蛋白基质蛋白
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿、老年人和免疫缺陷病人严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。RSV属于副粘病毒科肺病毒属,基因组为15.2 Kb的单股负链RNA,编码11种蛋白,其中黏附蛋白(Glycoprotein, G)和融合蛋白(Fusion protein,F)为RSV主要中和抗原,基质蛋白(Matrix protein, M)为RSV的骨架蛋白。从福尔马林灭活疫苗开始,已研制了多种形式的RSV疫苗,但由于安全性和免疫原性等问题,至今尚没有能够用于预防人RSV感染的疫苗问世。病毒样颗粒疫苗作为一种新型疫苗形式被广泛用于各种病毒疫苗研制,并获得较为理想的免疫效果和保护作用。迄今为止,人们对于RSV病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)的制备条件尚处探索阶段,仅有的一个关于RSV VLPs见于2008年美国一份专利申请书,但存在产量低、制备困难及未见免疫效果和免疫保护作用研究。本研究拟选用非复制型第一代腺病毒载体(First generation replication deficient recombinant adenoviral vector, FGAd)和杆状病毒表达载体分别构建表达RSV F、G、M的复制缺陷型重组腺病毒及重组杆状病毒,为进一步阐明RSV VLPs形成和出芽机制,以及获得RSV VLPs奠定实验基础。方法：参考GenBank登录的RSV A亚型Long株M、G蛋白基因序列,按照哺乳动物细胞密码子偏性,对M和G基因进行密码子优化,然后分别克隆到穿梭载体pShuttle-CMV,再经同源重组获得重组腺病毒质粒,分别转染293细胞,获得重组腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn, Western-blot鉴定目的基因表达。参考GenBank登录的RSV A亚型Long株F、G和M蛋白基因序列,按照昆虫细胞密码子偏性,对F、G和M基因进行密码子优化,然后分别克隆到穿梭载体pFast-BacⅠ,转座后获得重组杆状病毒质粒,分别转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt, Western-blot鉴定目的基因表达。结果：重组腺病毒DNA分子转染293细胞后,7d左右细胞出现肿胀,圆缩等典型的致细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE), Western blot检测到G和M基因的表达,获得非复制型重组腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn。重组杆状病毒质粒转染sf9细胞后,3d后出现细胞肿胀、细胞核增大和核内出现空泡等病变,Western blot检测到F、G和M基因的表达,获得重组杆状病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt o结论：成功获得FGAd-Gsyn、FGAd-Msyn、rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt,为阐明RSV VLPs形成和出芽机制,以及获得RSV VLPs奠定了实验基础。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
1 引言  11-14
2 实验材料  14-19
  2.1 细胞、毒株、载体与宿主菌  14
  2.2 工具酶与试剂盒  14
  2.3 主要生化试剂  14
  2.4 主要仪器  14-15
  2.5 主要溶剂配制  15-19
3 实验方法  19-31
  3.1 重组腺病毒的构建与鉴定  19-25
  3.2 重组杆状病毒的构建与鉴定  25-31
4 实验结果  31-43
  4.1 重组腺病毒的构建与鉴定  31-36
  4.2 重组杆状病毒的构建与鉴定  36-43
5 讨论  43-45
6 结论  45-46
参考文献  46-47
附录A  47-49
作者简历  49-51
学位论文数据集  51

表达人呼吸道合胞病毒结构蛋白的重组腺病毒及杆状病毒的构建与鉴定

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